Molekyylibiologia / mə lɛ VastaanottajaJʊ lər / on biologian ala, joka koskee biomolekyylien välisen biologisen aktiivisuuden molekyyliperustaa eri solujärjestelmissä, mukaan lukien DNA:n, RNA:n, proteiinien ja niiden biosynteesin väliset vuorovaikutukset sekä näiden vuorovaikutusten säätely. Ilmottautua luonto Vuonna 1961 Astbury kuvaili molekyylibiologiaa:

Ei niinkään tekniikka kuin lähestymistapa, lähestymistapa niin sanottujen perustieteiden näkökulmasta, jonka johtava ajatus on etsiä klassisen biologian laajamittaisten ilmentymien alta vastaavaa molekyylitasoa. Hän on huolissaan erityisesti lomakkeita biologisia molekyylejä ja [...] pääasiassa kolmiulotteisia ja rakenteellisia - mikä ei kuitenkaan tarkoita, että tämä olisi vain morfologian jalostus. Hänen on samalla tutkittava syntyä ja toimintoja.

Suhde muihin biologian tieteisiin

Molekyylibiologian tutkijat käyttävät erityisiä molekyylibiologian tekniikoita, mutta yhdistävät niitä yhä enemmän genetiikan ja biokemian menetelmiin ja ideoihin. Näiden tieteenalojen välillä ei ole selkeää rajaa. Tämä on havainnollistettu seuraavassa kaaviossa, joka kuvaa yhden mahdollisen kenttien välisen suhteen:

• Biokemia on tutkimus elävissä organismeissa esiintyvistä kemikaaleista ja elintärkeistä prosesseista. Biokemistien on vaikea keskittyä biomolekyylien rooliin, toimintaan ja rakenteeseen. Biokemian esimerkkejä ovat biologisten prosessien taustalla olevan kemian tutkimus ja biologisesti aktiivisten molekyylien synteesi.
• Genetiikka on tutkimus organismien geneettisten erojen vaikutuksista. Tämä voidaan usein päätellä normaalin komponentin (esim. yhden geenin) puuttumisesta. "Mutanttien" tutkimus ovat organismeja, joilla on yksi tai useampi toiminnallinen komponentti suhteessa niin kutsuttuun "villityyppiin" tai normaalifenotyyppiin. Geneettiset vuorovaikutukset (epistasis) sekoittavat usein tällaisten "poistotutkimusten" yksinkertaiset tulkinnat.
• Molekyylibiologia on tutkimus replikaatio-, transkriptio-, translaatio- ja solutoiminnan prosessien molekyyliperustasta. Molekyylibiologian keskeinen dogma, jossa geneettinen materiaali transkriptoidaan RNA:ksi ja muunnetaan sitten proteiiniksi, vaikka se on liian yksinkertaistettu, tarjoaa silti hyvän lähtökohdan alan ymmärtämiselle. Kuvaa on tarkistettu RNA:n uusien roolien valossa.

Molekyylibiologian menetelmät

Molekyylikloonaus

Yksi molekyylibiologian perustekniikoista proteiinien toiminnan tutkimiseksi on molekyylikloonaus. Tässä tekniikassa mielenkiinnon kohteena olevaa proteiinia koodaava DNA kloonataan käyttämällä polymeraasiketjureaktiota (PCR) ja/tai restriktioentsyymejä plasmidiin (ekspressiovektoriin). Vektorilla on 3 ominaispiirrettä: replikaation aloituskohta, monikloonauskohta (MCS) ja selektiomarkkeri, yleensä antibioottiresistenssille. Moninkertaisesta kloonauskohdasta ylävirtaan ovat promoottori- ja transkription aloituskohdan alueet, jotka säätelevät kloonatun geenin ilmentymistä. Tämä plasmidi voidaan liittää joko bakteeri- tai eläinsoluihin. DNA:n vieminen bakteerisoluihin voidaan tehdä transformoimalla ottamalla paljaat DNA:ta, konjugoimalla solu-solukontaktien avulla tai transduktiolla virusvektorin kanssa. DNA:n viemistä eukaryoottisoluihin, kuten eläinsoluihin, fysikaalisin tai kemiallisin keinoin kutsutaan transfektioksi. Saatavilla on useita erilaisia ​​transfektiomenetelmiä, kuten kalsiumfosfaattitransfektio, elektroporaatio, mikroinjektio ja liposomitransfektio. Plasmidi voidaan integroida genomiin, mikä johtaa stabiiliin transfektioon, tai se voi pysyä riippumattomana genomista, jota kutsutaan transfektiotransienteiksi.

Kiinnostuksen kohteena olevia proteiineja koodaava DNA on nyt solun sisällä, ja proteiinit voidaan nyt ekspressoida. Erilaiset järjestelmät, kuten indusoituvat promoottorit ja spesifiset solusignalointitekijät, jotka auttavat ilmaisemaan proteiinikiinnostusta korkeilla tasoilla. Suuria määriä proteiinia voidaan sitten uuttaa bakteeri- tai eukaryoottisolusta. Proteiinin entsymaattista aktiivisuutta voidaan testata eri tilanteissa, proteiini voidaan kiteyttää niin, että sen tertiääristä rakennetta voidaan tutkia, tai lääketeollisuudessa voidaan tutkia uusien lääkkeiden aktiivisuutta proteiinia vastaan.

Polymeraasiketjureaktio

Makromolekyylien blottaus ja tutkimus

Ehdot pohjoinen , länteen Ja itämainen blotting on peräisin siitä, mikä oli alun perin molekyylibiologian vitsiä, jota leikittiin termillä Southernnet Edwin Southernin BLOTTED DNA -hybridisaatiolle kuvaaman tekniikan mukaisesti. Patricia Thomas, RNA-blottauksen kehittäjä, joka sitten tuli tunnetuksi nimellä Northern - blotting, älä käytä tuota termiä.

Southern blotting

Keksijänsä, biologi Edwin Southernin mukaan nimetty Southern blot on menetelmä, jolla testataan tietyn DNA-sekvenssin läsnäolo DNA-näytteessä. DNA-näytteet ennen tai jälkeen restriktioentsyymi (restriktioentsyymi) digestiota erotetaan geelielektroforeesilla ja siirretään sitten kalvolle blottauksella kapillaarivaikutusta käyttäen. Kalvo altistetaan sitten leimatulle DNA-koettimelle, jonka emässekvenssi on komplementaarinen kiinnostuksen kohteena olevan DNA:n sekvenssin kanssa. Southern-blottausta käytetään vähemmän laajalti tieteellisessä laboratoriossa, koska muut menetelmät, kuten PCR, pystyvät havaitsemaan spesifisiä DNA-sekvenssejä DNA-näytteistä. Näitä blotteja käytetään kuitenkin edelleen joissakin sovelluksissa, kuten siirtogeenin kopioluvun mittaamisessa siirtogeenisissä hiirissä tai geenitekniikan knockout alkion kantasolulinjoissa.

Northern blottaus

Northern blot -kaavio

Eastern blot

Kliininen tutkimus ja molekyylibiologiasta johtuvat lääkehoidot kuuluvat osittain geeniterapian piiriin. Molekyylibiologian tai molekyylisolubiologian lähestymistapojen soveltamista lääketieteeseen kutsutaan nykyään molekyylilääketieteeksi. Molekyylibiologialla on myös tärkeä rooli solujen eri osien muodostumisen, toiminnan ja säätelyn ymmärtämisessä, jonka avulla voidaan tehokkaasti kohdistaa uusia lääkkeitä, diagnosoida sairauksia ja ymmärtää solufysiologiaa.

lisälukemista

• Cohen, S.N., Chang, N.K.D., Boyer, H. & Heling, R.B. Biologisesti funktionaalisten bakteeriplasmidien rakentaminen in vitro .

31.2

Kavereille!

Viite

Molekyylibiologia syntyi biokemiasta huhtikuussa 1953. Sen ulkonäkö liittyy James Watsonin ja Francis Crickin nimiin, jotka löysivät DNA-molekyylin rakenteen. Löytö tehtiin mahdolliseksi genetiikan, bakteerien ja virusten biokemian tutkimuksen kautta. Molekyylibiologin ammatti ei ole laajalle levinnyt, mutta nykyään sen rooli nyky-yhteiskunnassa on erittäin suuri. Monet sairaudet, mukaan lukien ne, jotka ilmenevät geneettisellä tasolla, vaativat tutkijoita löytämään ratkaisuja tähän ongelmaan.

Toiminnan kuvaus

Virukset ja bakteerit mutatoituvat jatkuvasti, jolloin lääkkeet eivät enää auta ihmistä ja sairauksia on vaikea parantaa. Molekyylibiologian tehtävänä on päästä tämän prosessin edelle ja kehittää uusi lääke sairauksiin. Tiedemiehet työskentelevät vakiintuneen järjestelmän mukaisesti: estävät taudin syyn, poistavat perinnöllisyysmekanismit ja siten helpottavat potilaan tilaa. Maailmassa on useita keskuksia, klinikoita ja sairaaloita, joissa molekyylibiologit kehittävät uusia hoitomenetelmiä potilaiden auttamiseksi.

Työvastuudet

Molekyylibiologin tehtäviin kuuluu solun sisäisten prosessien (esim. DNA:n muutosten kasvainten kehittymisen aikana) tutkiminen. Asiantuntijat tutkivat myös DNA:n ominaisuuksia, niiden vaikutusta koko organismiin ja yksittäiseen soluun. Tällaisia ​​tutkimuksia tehdään esimerkiksi PCR:n (polymeraasiketjureaktion) perusteella, mikä mahdollistaa kehon analysoinnin infektioiden, perinnöllisten sairauksien varalta ja biologisen sukulaisuuden määrittämisen.

Urakasvun piirteet

Molekyylibiologin ammatti on alallaan varsin lupaava ja jo nyt ykkössijalla tulevaisuuden lääketieteen ammattien listalla. Muuten, molekyylibiologin ei tarvitse olla koko ajan tällä alalla. Jos on halu vaihtaa ammattiaan, hän voi kouluttautua uudelleen laboratoriolaitteiden myyntipäälliköksi, aloittaa instrumenttien kehittämisen erilaisiin opintoihin tai perustaa oman yrityksen.

1. Esittely.

Molekyylibiologian ja genetiikan oppiaine, tehtävät ja menetelmät. "Klassisen" genetiikan ja mikro-organismien genetiikan merkitys molekyylibiologian ja geenitekniikan kehityksessä. Geenin käsite "klassisessa" ja molekyyligenetiikassa, sen evoluutio. Geenitekniikan metodologian panos molekyyligenetiikan kehitykseen. Geenitekniikan soveltava merkitys bioteknologialle.

2. Perinnöllisyyden molekyyliperusta.

Solun käsite, sen makromolekyylikoostumus. Geneettisen materiaalin luonne. DNA:n geneettisen toiminnan todisteiden historia.

2.1. Erilaisia ​​nukleiinihappoja. Nukleiinihappojen biologiset toiminnot. Nukleiinihappojen kemiallinen rakenne, tilarakenne ja fysikaaliset ominaisuudet. Pro- ja eukaryoottien geneettisen materiaalin rakenteen piirteet. Täydentävät Watson-Crick-emäsparit. Geneettinen koodi. Geneettisen koodin purkamisen historia. Koodin perusominaisuudet: kolmoisuus, koodi ilman pilkkuja, degeneraatio. Koodisanakirjan ominaisuudet, kodoniperheet, semanttiset ja "nonsense"-kodonit. Pyöreät DNA-molekyylit ja DNA:n superkiertymisen käsite. DNA topoisomeerit ja niiden tyypit. Topoisomeraasien toimintamekanismit. Bakteerien DNA-gyraasi.

2.2. DNA:n transkriptio. Prokaryoottinen RNA-polymeraasi, sen alayksikkö ja kolmiulotteiset rakenteet. Erilaisia ​​sigmatekijöitä. Prokaryoottigeenin promoottori, sen rakenneosat. Transkriptiosyklin vaiheet. Transkription aloitus, "avoimen kompleksin" muodostuminen, venyminen ja lopettaminen. Transkription vaimennus. Tryptofaanioperonien ilmentymisen säätely. "Riboswitches." Transkription lopetusmekanismit. Transkription negatiivinen ja positiivinen säätely. Laktoosi operoni. Transkription säätely lambda-faagikehityksessä. DNA:n tunnistamisen periaatteet säätelyproteiinien (CAP-proteiini ja lambda-faagirepressori) avulla. Eukaryoottien transkription ominaisuudet. RNA:n prosessointi eukaryooteissa. Transkriptien päättäminen, silmukointi ja polyadenylaatio. Liitosmekanismit. Pienten tuman RNA:iden ja proteiinitekijöiden rooli. Vaihtoehtoinen liitos, esimerkkejä.

2.3. Lähettää, sen vaiheet, ribosomin toiminta. Ribosomien lokalisointi soluun. Prokaryoottiset ja eukaryoottiset ribosomityypit; 70S ja 80S ribosomit. Ribosomien morfologia. Jako alahiukkasiin (alayksiköihin). Kodonista riippuvainen aminoasyyli-tRNA:n sitoutuminen elongaatiosyklissä. Kodoni-antikodoni vuorovaikutus. Pidentymätekijän EF1 (EF-Tu) osallistuminen aminoasyyli-tRNA:n sitoutumiseen ribosomiin. Venymätekijä EF1B (EF-Ts), sen toiminta, reaktiosarja sen osallistumisella. Antibiootit, jotka vaikuttavat aminoasyyli-tRNA:n kodonista riippuvaisen sitoutumisen vaiheessa ribosomiin. Aminoglykosidiantibiootit (streptomysiini, neomysiini, kanamysiini, gentamysiini jne.), niiden vaikutusmekanismi. Tetrasykliinit aminoasyyli-tRNA:n ribosomiin sitoutumisen estäjinä. Lähetyksen aloitus. Aloitusprosessin päävaiheet. Translaation aloitus prokaryooteissa: aloitustekijät, aloituskodonit, pienen ribosomaalisen alayksikön RNA:n 3¢-pää ja Shine-Dalgarno-sekvenssi mRNA:ssa. Translaation aloitus eukaryooteissa: aloitustekijät, aloituskodonit, 5¢ transloimaton alue ja cap-riippuvainen "terminaalinen" aloitus. "Sisäinen" korkista riippumaton aloitus eukaryooteissa. Transpeptidaatio. Transpeptidaation estäjät: kloramfenikoli, linkomysiini, amysetiini, streptogramiinit, anisomysiini. Translokaatio. Venymäkertoimen EF2 (EF-G) ja GTP:n osallisuus. Translokaatioestäjät: fusidiinihappo, viomysiini, niiden vaikutusmekanismit. Lähetyksen lopettaminen. Lopeta kodonit. Prokaryoottien ja eukaryoottien proteiinin lopetustekijät; kaksi lopetustekijöiden luokkaa ja niiden vaikutusmekanismit. Käännöksen säätely prokaryooteissa.

2.4. DNA kopiointi ja sen geneettinen hallinta. Replikaatioon osallistuvat polymeraasit, niiden entsymaattisten toimintojen ominaisuudet. DNA-toiston tarkkuus. DNA-emäsparien välisten steeristen vuorovaikutusten rooli replikaation aikana. E. coli -polymeraasit I, II ja III. Polymeraasi III -alayksiköt. Replikointihaarukka, "johtavat" ja "jäävät" säikeet replikaation aikana. Fragmentteja Okazakista. Proteiinikompleksi replikaatiohaarukassa. Replikaation aloituksen säätely E. colissa. Replikaation lopettaminen bakteereissa. Plasmidin replikaation säätelyn piirteet. Kaksisuuntainen ja pyörivä ympyräkopiointi.

2.5. Rekombinaatio, sen tyypit ja mallit. Yleinen tai homologinen rekombinaatio. DNA:n kaksoisjuoste katkeaa, mikä käynnistää rekombinaation. Rekombinaation rooli kaksisäikeisten katkeamien replikatiivisessa korjauksessa. Holliday-rakenne rekombinaatiomallissa. Yleisen rekombinaation entsymologia E. colissa. RecBCD-kompleksi. RecA-proteiini. Rekombinaation rooli DNA-synteesin varmistamisessa replikaation keskeyttävien DNA-vaurioiden aikana. Rekombinaatio eukaryooteissa. Rekombinaatioentsyymit eukaryooteissa. Paikkakohtainen rekombinaatio. Erot yleisen ja paikkaspesifisen rekombinaation molekyylimekanismeissa. Rekombinaasien luokitus. Paikkaspesifisen rekombinaation aikana suoritettujen kromosomien uudelleenjärjestelyjen tyypit. Paikkaspesifisen rekombinaation säätelyrooli bakteereissa. Monisoluisten eukaryoottien kromosomien rakentaminen käyttämällä faagipaikkaspesifistä rekombinaatiojärjestelmää.

2.6. DNA:n korjaus. Korjaustyyppien luokittelu. Tymiinidimeerien ja metyloidun guaniinin suora korjaus. Pohjien leikkaaminen. Glykosylaasit. Pariutumattomien nukleotidien korjausmekanismi (epäsopivuuskorjaus). Korjattavan DNA-juosteen valinta. SOS-korjaus. Prokaryoottien ja eukaryoottien SOS-korjaukseen osallistuvien DNA-polymeraasien ominaisuudet. "Adaptiivisten mutaatioiden" käsite bakteereissa. Kaksijuosteisten katkeamien korjaaminen: homologinen replikaation jälkeinen rekombinaatio ja DNA-molekyylin ei-homologisten päiden yhdistäminen. Replikaatio-, rekombinaatio- ja korjausprosessien välinen suhde.

3. Mutaatioprosessi.

Biokemiallisten mutanttien rooli yksi geeni – yksi entsyymi -teorian muodostumisessa. Mutaatioiden luokittelu. Pistemutaatiot ja kromosomien uudelleenjärjestelyt, niiden muodostumismekanismi. Spontaani ja indusoitu mutageneesi. Mutageenien luokitus. Mutageneesin molekyylimekanismi. Mutageneesin ja korjauksen välinen suhde. Mutanttien tunnistaminen ja valinta. Suppressio: intrageeninen, intergeeninen ja fenotyyppinen.

4. Ekstrakromosomaaliset geneettiset elementit.

Plasmidit, niiden rakenne ja luokittelu. Sukupuolitekijä F, sen rakenne ja elinkaari. Tekijän F rooli kromosomisiirron mobilisaatiossa. Hfr- ja F-tyypin luovuttajien muodostuminen." Konjugaatiomekanismi. Bakteriofagit, niiden rakenne ja elinkaari. Virulentit ja lauhkeat bakteriofagit. Lysogenia ja transduktio. Yleinen ja spesifinen transduktio. Siirtyvät geneettiset elementit: transposonit ja IS-sekvenssit, niiden rooli DNA-transposonit prokaryoottien ja eukaryoottien genomissa, niiden rakenne bakteerien F-tekijän osana, mikä määrittää geneettisen materiaalin kyvyn siirtyä konjugaation aikana. transposonien replikatiiviset ja replikatiiviset mekanismit ja niiden rooli rakenteellisissa uudelleenjärjestelyissä (ektooppinen rekombinaatio) ja genomin evoluutiossa.

5. Geenirakenteen ja toiminnan tutkimus.

Geneettisen analyysin elementit. Cis-trans-komplementaatiotesti. Geneettinen kartoitus konjugaatiolla, transduktiolla ja transformaatiolla. Geneettisten karttojen rakentaminen. Hieno geneettinen kartoitus. Geenirakenteen fyysinen analyysi. Heteroduplex-analyysi. Rajoitusanalyysi. Sekvensointimenetelmät. Polymeraasiketjureaktio. Geenitoiminnan tunnistaminen.

6. Geeniekspression säätely. Käsitteet operonista ja regulonista. Kontrolli transkription aloitustasolla. Promoottori-, operaattori- ja säätelyproteiinit. Geeniekspression positiivinen ja negatiivinen kontrolli. Ohjaus transkription lopettamisen tasolla. Kataboliittikontrolloidut operonit: mallit laktoosi-, galaktoosi-, arabinoosi- ja maltoosioperoneista. Vaimentimella ohjatut operonit: tryptofaanioperonin malli. Geeniekspression moniarvoinen säätely. Globaalit sääntelyjärjestelmät. Sääntelyreaktio stressiin. Transkription jälkeinen ohjaus. Signaalin siirto. RNA:ta koskeva säätely: pienet RNA:t, sensori-RNA:t.

7. Geenitekniikan perusteet. Restriktio- ja modifiointientsyymit. Geenien eristäminen ja kloonaus. Vektorit molekyylikloonausta varten. Rekombinantti-DNA:n suunnittelun periaatteet ja niiden vieminen vastaanottajasoluihin. Geenitekniikan soveltavat näkökohdat.

A). Pääkirjallisuus:

1. Watson J., Tooze J., Recombinant DNA: A Short Course. – M.: Mir, 1986.

2. Geenit. – M.: Mir. 1987.

3. Molekyylibiologia: nukleiinihappojen rakenne ja biosynteesi. /Toim. . – M. Korkeakoulu. 1990.

4. – Molekyylibioteknologia. M. 2002.

5. Spiriiniribosomit ja proteiinien biosynteesi. – M.: Korkeakoulu, 1986.

b). Lisäkirjallisuutta:

1. Hesinin genomi. – M.: Tiede. 1984.

2. Rybchinin geenitekniikka. – Pietari: Pietarin valtion teknillinen yliopisto. 1999.

3. Patruševin geenit. – M.: Nauka, 2000.

4. Moderni mikrobiologia. Prokaryootit (2 osassa). – M.: Mir, 2005.

5. M. Singer, P. Berg. Geenit ja genomit. – M.: Mir, 1998.

6. Shchelkunov-tekniikka. – Novosibirsk: Sib. Yliopisto, 2004.

7. Stepanov-biologia. Proteiinien rakenne ja toiminta. – M.: V. Sh., 1996.

Voidaan sanoa, että molekyylibiologia tutkii elämän ilmenemismuotoja elottomissa rakenteissa tai järjestelmissä, joissa on alkeellisia merkkejä elintärkeästä toiminnasta (jotka voivat olla yksittäisiä biologisia makromolekyylejä, niiden komplekseja tai organelleja), tutkien, kuinka elävää ainetta kuvaavat avainprosessit toteutuvat kemiallisten vuorovaikutusten ja muunnoksia.

Molekyylibiologian erottaminen biokemiasta itsenäiseksi tieteenalaksi sanelee se, että sen päätehtävänä on tutkia eri prosesseissa mukana olevien biologisten makromolekyylien rakennetta ja ominaisuuksia sekä selvittää niiden vuorovaikutuksen mekanismeja. Biokemia tutkii todellisia elämän prosesseja, niiden esiintymismalleja elävässä organismissa ja näitä prosesseja seuraavien molekyylien muunnoksia. Lopulta molekyylibiologia yrittää vastata kysymykseen, miksi tietty prosessi tapahtuu, kun taas biokemia vastaa kysymyksiin missä ja miten kemiallisesta näkökulmasta kyseinen prosessi tapahtuu.

Tarina

Molekyylibiologia erillisenä biokemian haarana alkoi muotoutua viime vuosisadan 30-luvulla. Silloin elämän ilmiön syvemmälle ymmärtämiselle syntyi tarve kohdennetulle tutkimukselle elävien organismien perinnöllisen tiedon varastointi- ja siirtoprosessien molekyylitasolla. Sitten määritettiin molekyylibiologian tehtävä nukleiinihappojen ja proteiinien rakenteen, ominaisuuksien ja vuorovaikutuksen tutkimuksessa. Termiä "molekyylibiologia" käytti ensimmäisenä englantilainen tiedemies William Astbury tutkimuksissa, jotka liittyivät fibrillaaristen proteiinien, kuten kollageenin, veren fibriinin tai lihasten supistumisproteiinien molekyylirakenteen ja fysikaalisten ja biologisten ominaisuuksien välisiin suhteisiin.

Molekyylibiologian alkuaikoina RNA:ta pidettiin kasvien ja sienten komponenttina ja DNA:ta tyypillisenä eläinsolujen komponenttina. Ensimmäinen tutkija, joka osoitti DNA:n olevan kasveissa, oli Andrei Nikolajevitš Belozersky, joka eristi herneen DNA:n vuonna 1935. Tämä löytö vahvisti sen tosiasian, että DNA on universaali nukleiinihappo, jota esiintyy kasvi- ja eläinsoluissa.

Suuri saavutus oli George Beadlen ja Edward Tatumin perustaminen suorasta syy-seuraussuhteesta geenien ja proteiinien välille. Kokeissaan he paljastivat Neurospora-soluja ( Neurosporacrassa) Röntgensäteily, joka aiheutti mutaatioita. Saadut tulokset osoittivat, että tämä johti muutoksiin tiettyjen entsyymien ominaisuuksissa.

Vuonna 1940 Albert Claude eristi sytoplasmista RNA:ta sisältäviä rakeita eläinsolujen sytoplasmasta, jotka olivat pienempiä kuin mitokondriot. Hän kutsui niitä mikrosomeiksi. Myöhemmin tutkittaessa eristettyjen hiukkasten rakennetta ja ominaisuuksia todettiin niiden perustavanlaatuinen rooli proteiinien biosynteesiprosessissa. Vuonna 1958 ensimmäisessä näille hiukkasille omistetussa symposiumissa näitä hiukkasia päätettiin kutsua ribosomeiksi.

Toinen tärkeä askel molekyylibiologian kehityksessä oli Oswald Averyn, Colin MacLeodin ja MacLean McCarthyn vuonna 1944 julkaistu kokeen tiedot, jotka osoittivat DNA:n olevan syy bakteerien transformaatioon. Tämä oli ensimmäinen kokeellinen todiste DNA:n roolista perinnöllisen tiedon välittämisessä, mikä kumosi aiemmin vallinneen käsityksen geenien proteiiniluonteesta.

Frederick Sanger osoitti 1950-luvun alussa, että proteiiniketju on ainutlaatuinen aminohappotähteiden sekvenssi. 50-luvun lopulla Max Perutz ja John Kendrew selvittivät ensimmäisten proteiinien spatiaalisen rakenteen. Jo vuonna 2000 tunnettiin satoja tuhansia luonnollisia aminohapposekvenssejä ja tuhansia proteiinien spatiaalisia rakenteita.

Samoihin aikoihin Erwin Chargaffin tutkimus antoi hänelle mahdollisuuden muotoilla säännöt, jotka kuvaavat typpipitoisten emästen suhdetta DNA:ssa (säännöissä sanotaan, että DNA:n lajieroista riippumatta guaniinin määrä on yhtä suuri kuin sytosiinin määrä ja adeniini on yhtä suuri kuin teminin määrä), joka myöhemmin auttoi tekemään suurimman läpimurron molekyylibiologiassa ja yhden biologian suurimmista löydöistä yleensä.

Tämä tapahtuma tapahtui vuonna 1953, kun James Watson ja Francis Crick perustuivat Rosalind Franklinin ja Maurice Wilkinsin teoksiin. Röntgenrakenneanalyysi DNA loi DNA-molekyylin kaksijuosteisen rakenteen. Tämä löytö teki mahdolliseksi vastata peruskysymykseen perinnöllisen tiedon kantajan kyvystä toistaa itseään ja ymmärtää tällaisen tiedon välitysmekanismia. Nämä samat tutkijat muotoilivat typpipitoisten emästen komplementaarisuuden periaatteen, joka on avainasemassa supramolekyylisten rakenteiden muodostumismekanismin ymmärtämisessä. Tämä periaate, jota käytetään nyt kuvaamaan kaikkia molekyylikomplekseja, antaa meille mahdollisuuden kuvata ja ennustaa heikkojen (ei-valenttien) molekyylien välisten vuorovaikutusten esiintymisen olosuhteita, jotka määrittävät sekundääristen, tertiääristen jne. makromolekyylien rakenne, supramolekulaaristen biologisten järjestelmien itsensä kokoamisen kulku, jotka määräävät niin laajan valikoiman molekyylirakenteita ja niiden toiminnallisia kokonaisuuksia. Samaan aikaan, vuonna 1953, syntyi tieteellinen aikakauslehti Journal of Molecular Biology. Sitä johti John Kendrew, jonka tieteellisten intressien alue oli globulaaristen proteiinien rakenteen tutkimus (Nobel-palkinto vuonna 1962 yhdessä Max Perutzin kanssa). V. A. Engelhardt perusti Neuvostoliitossa samanlaisen venäjänkielisen lehden nimeltä "Molecular Biology" vuonna 1966.

Vuonna 1958 Francis Crick muotoili ns. molekyylibiologian keskeinen dogma: ajatus geneettisen tiedon virtauksen peruuttamattomuudesta DNA:sta RNA:n kautta proteiineihin kaavion DNA → DNA (replikaatio, DNA:n kopion luominen), DNA → RNA ( transkriptio, geenien kopiointi), RNA → proteiini (translaatio, dekoodaus tietoa rakenneproteiineista). Tätä dogmaa korjattiin jonkin verran vuonna 1970 ottaen huomioon kertynyt tieto, koska käänteistranskription ilmiön löysivät itsenäisesti Howard Temin ja David Baltimore: löydettiin entsyymi, käänteiskopioija, joka on vastuussa käänteiskopioinnista - kaksoistranskription muodostumisesta. yksijuosteisessa RNA-templaatissa, jota esiintyy onkogeenisissä viruksissa. On huomattava, että tiukka vaatimus geneettisen tiedon kulkusta nukleiinihapoista proteiineihin on edelleen molekyylibiologian perusta.

Vuonna 1957 Alexander Sergeevich Spirin osoitti yhdessä Andrei Nikolajevitš Belozerskyn kanssa, että huolimatta merkittävistä eroista eri organismien DNA:n nukleotidikoostumuksessa, kokonais-RNA:n koostumus on samanlainen. Näiden tietojen perusteella he tulivat sensaatiomaiseen johtopäätökseen, että solun kokonais-RNA ei voi toimia geneettisen tiedon kantajana DNA:sta proteiineihin, koska se ei vastaa sitä koostumukseltaan. Samalla he huomasivat, että RNA:ta on pieni osa, joka vastaa nukleotidikoostumukseltaan täysin DNA:ta ja joka voi olla todellinen geneettisen tiedon kantaja DNA:sta proteiineihin. Tämän seurauksena he ennustivat suhteellisen pienten RNA-molekyylien olemassaolon, jotka ovat rakenteeltaan analogisia yksittäisten DNA-osien kanssa ja toimivat välittäjinä DNA:n sisältämän geneettisen tiedon siirtämisessä ribosomiin, jossa proteiinimolekyylejä syntetisoidaan tämän tiedon avulla. Vuonna 1961 (S. Brenner, F. Jacob, M. Meselson toisaalta ja F. Gros, Francois Jacob ja Jacques Monod olivat ensimmäisiä, jotka saivat kokeellisen vahvistuksen tällaisten molekyylien - informaatio (lähetti) RNA:n olemassaolosta. Samaan aikaan he kehittivät funktionaalisen DNA-yksikön - operonin - käsitteen ja mallin, joka mahdollisti tarkasti, kuinka geenin ilmentymisen säätely prokaryooteissa tapahtuu. Tutkimus proteiinien biosynteesin mekanismeista ja rakenteellisen organisaation periaatteista ja molekyylikoneiden - ribosomien - toiminta mahdollisti geneettisen tiedon liikkumista kuvaavan postulaatin, jota kutsutaan molekyylibiologian keskeiseksi dogmaksi: DNA - mRNA on proteiini.

Vuonna 1961 ja muutaman seuraavan vuoden aikana Heinrich Matthai ja Marshall Nirenberg sekä sitten Har Korana ja Robert Holley suorittivat useita tutkimuksia geneettisen koodin tulkitsemiseksi, minkä seurauksena DNA:n rakenteen ja syntetisoidut proteiinit ja nukleotidisekvenssi, joka määrittää proteiinin aminohappojoukon. Tietoa saatiin myös geneettisen koodin universaalisuudesta. Löydökset palkittiin Nobel-palkinnolla vuonna 1968.

RNA:n toimintoja koskevien nykyaikaisten ideoiden kehittämisen kannalta ratkaisevaa oli ei-koodaavien RNA:iden löytäminen, joka perustui Alexander Sergeevich Spirinin yhdessä Andrei Nikolaevich Belozerskyn vuonna 1958, Charles Brennerin ja muiden kirjoittajien sekä Saul Spiegelmanin työn tuloksiin. vuonna 1961. Tämän tyyppinen RNA muodostaa suurimman osan solujen RNA:sta. Ei-koodaaviin RNA:ihin kuuluvat ensisijaisesti ribosomaaliset RNA:t.

Eläinsolujen viljely- ja hybridisointimenetelmät ovat saaneet merkittävää kehitystä. Vuonna 1963 Francois Jacob ja Sidney Brenner muotoilivat ajatuksen replikonista - luontaisesti replikoituvien geenien sekvenssistä, joka selittää tärkeitä näkökohtia geenin replikaation säätelyssä.

Vuonna 1967 A. S. Spirinin laboratoriossa osoitettiin ensimmäisen kerran, että tiiviisti laskostuneen RNA:n muoto määrittää ribosomaalisen partikkelin morfologian.

Vuonna 1968 tehtiin merkittävä perustavanlaatuinen löytö. Okazaki, joka löysi jäljessä olevan juosteen DNA-fragmentteja tutkiessaan replikaatioprosessia, nimesi Okazaki-fragmentit hänen mukaansa, selvensi DNA:n replikaation mekanismia.

Vuonna 1970 Howard Temin ja David Baltimore tekivät itsenäisesti merkittävän löydön: he löysivät revertaasientsyymin, joka on vastuussa käänteistranskriptiosta - kaksijuosteisen DNA:n muodostumisesta yksijuosteiselle RNA-templaatille, jota esiintyy RNA:ta sisältävissä onkogeenisissä viruksissa.

Toinen tärkeä molekyylibiologian saavutus oli mutaatioiden mekanismin selittäminen molekyylitasolla. Tutkimussarjan tuloksena määritettiin mutaatioiden päätyypit: duplikaatiot, inversiot, deleetiot, translokaatiot ja transpositiot. Tämä mahdollisti evoluutiomuutosten tarkastelun geneettisten prosessien näkökulmasta ja mahdollisti fylogeniassa käytettävän molekyylikellojen teorian kehittämisen.

70-luvun alkuun mennessä muotoiltiin nukleiinihappojen ja proteiinien toiminnan perusperiaatteet elävässä organismissa. Havaittiin, että kehon proteiinit ja nukleiinihapot syntetisoidaan matriisimekanismin avulla. Matriisimolekyyli kuljettaa salattua tietoa aminohappojen (proteiinissa) tai nukleotidien (nukleiinihapossa) sekvenssistä. Replikaation (DNA-kaksoistumisen) tai transkription (mRNA-synteesi) aikana DNA toimii sellaisena matriisina translaation (proteiinisynteesi) tai käänteistranskription aikana, mRNA toimii sellaisena matriisina.

Siten luotiin teoreettiset edellytykset molekyylibiologian soveltavien alojen, erityisesti geenitekniikan, kehittämiselle. Vuonna 1972 Paul Berg, Herbert Boer ja Stanley Cohen kehittivät molekyylikloonausteknologiaa. Sitten he olivat ensimmäiset, jotka saivat rekombinantti-DNA:n in vitro. Nämä upeat kokeet loivat perustan geenitekniikalle, ja tätä vuotta pidetään tämän tieteenalan syntymäpäivänä.

Vuonna 1977 Frederick Sanger ja itsenäisesti Allan Maxam ja Walter Gilbert kehittivät erilaisia ​​menetelmiä DNA:n primäärirakenteen (sekvensoinnin) määrittämiseksi. Sanger-menetelmä, ns. ketjun lopetusmenetelmä, on nykyaikaisen sekvensoinnin perusta. Sekvensointiperiaate perustuu leimattujen emästen käyttöön, jotka toimivat terminaattoreina pyöreässä sekvensointireaktiossa. Tämä menetelmä on tullut laajalle, koska se pystyy suorittamaan analyysin nopeasti.

1976 - Frederick. Sanger salasi faagin φΧ174 DNA:n nukleotidisekvenssin, 5375 nukleotidiparia pitkä.

1981 – Sirppisolutautista tulee ensimmäinen geneettinen sairaus, joka diagnosoidaan DNA-testauksella.

RNA:n katalyyttisen toiminnan löytäminen T. Checkin ja S. Altmanin amerikkalaisissa laboratorioissa vuosina 1982-1983 muutti olemassa olevaa käsitystä proteiinien yksinomaisesta roolista. Analogisesti katalyyttisten proteiinien - entsyymien kanssa, katalyyttisiä RNA:ita kutsuttiin ribotsyymeiksi.

1987 Keri Mullez löysi polymeraasiketjureaktion, jonka ansiosta on mahdollista lisätä keinotekoisesti merkittävästi DNA-molekyylien määrää liuoksessa jatkotyöskentelyä varten. Nykyään tämä on yksi tärkeimmistä molekyylibiologian menetelmistä, jota käytetään perinnöllisten ja virussairauksien tutkimuksessa, geenitutkimuksessa ja identiteetin ja sukulaisuuden geneettisessä tunnistamisessa jne.

Vuonna 1990 kolme tutkijaryhmää julkaisi samanaikaisesti menetelmän, joka mahdollisti synteettisen toiminnallisesti aktiivisen RNA:n (keinotekoiset ribotsyymit tai molekyylit, jotka ovat vuorovaikutuksessa erilaisten ligandien - aptameerien) nopean saamisen laboratoriossa. Tätä menetelmää kutsutaan "evoluutioksi in vitro". Ja pian sen jälkeen, vuosina 1991-1993, A.B.:n laboratoriossa. Quadruple osoitti kokeellisesti RNA-molekyylien olemassaolon, kasvun ja monistumisen mahdollisuuden pesäkkeiden muodossa kiinteällä alustalla.

Vuonna 1998, lähes samanaikaisesti, Craig Mello ja Andrew Fire kuvasivat mekanismia, joka havaittiin aiemmin geenikokeiden aikana bakteereilla ja kukilla. RNA:n häiriö, jossa pieni kaksijuosteinen RNA-molekyyli johtaa spesifiseen geeniekspression suppressioon.

RNA-interferenssimekanismin löytämisellä on erittäin tärkeä käytännön merkitys nykyaikaiselle molekyylibiologialle. Tätä ilmiötä käytetään laajalti tieteellisissä kokeissa välineenä "sammutukseen" eli yksittäisten geenien ilmentymisen tukahduttamiseen. Erityisen mielenkiintoista on se tosiasia, että tämä menetelmä mahdollistaa tutkittavien geenien aktiivisuuden palautuvan (tilapäisen) tukahdutuksen. Parhaillaan tutkitaan mahdollisuutta käyttää tätä ilmiötä virus-, kasvain-, rappeuma- ja aineenvaihduntasairauksien hoidossa. On huomattava, että vuonna 2002 löydettiin mutanttipolioviruksia, jotka pystyivät välttämään RNA:n häiriötä, joten tähän ilmiöön perustuvien aidosti tehokkaiden hoitomenetelmien kehittäminen vaatii enemmän työtä.

Vuosina 1999-2001 useat tutkijaryhmät määrittelivät bakteeriribosomin rakenteen 5,5 - 2,4 angströmin resoluutiolla.

Tuote

Molekyylibiologian saavutuksia elävän luonnon tuntemisessa on vaikea yliarvioida. Menestystä on saavutettu onnistuneen tutkimuskonseptin ansiosta: monimutkaisia ​​biologisia prosesseja tarkastellaan yksittäisten molekyylijärjestelmien näkökulmasta, mikä mahdollistaa tarkkojen fysikaalis-kemiallisten tutkimusmenetelmien käytön. Tämä houkutteli tälle tieteen alueelle myös monia suuria mieliä läheisiltä aloilta: kemiasta, fysiikasta, sytologiasta, virologiasta, millä oli myös myönteinen vaikutus tämän alan tieteellisen tiedon laajuuteen ja kehitysnopeuteen. Sellaiset merkittävät löydöt kuin DNA:n rakenteen määrittäminen, geneettisen koodin purkaminen ja keinotekoisesti kohdennettu genomin muuntaminen ovat mahdollistaneet merkittävästi paremmin organismien kehitysprosessien erityispiirteiden ymmärtämisen ja onnistuneet ratkaisemaan lukuisia tärkeitä perustavanlaatuisia ja soveltavia tieteellisiä, lääketieteellisiä ja sosiaaliset ongelmat, joita ei niin kauan sitten pidetty ratkaisemattomina.

Molekyylibiologian tutkimuskohteena ovat pääasiassa proteiinit, nukleiinihapot ja niihin perustuvat molekyylikompleksit (molekyylikoneet) ja prosesseja, joihin ne osallistuvat.

Nukleiinihapot ovat lineaarisia polymeerejä, jotka koostuvat nukleotidiyksiköistä (yhdisteet viisijäsenisestä sokerista, jossa on fosfaattiryhmä syklin viidennessä atomissa ja yksi neljästä typpipitoisesta emäksestä), jotka on yhdistetty toisiinsa fosfaattiryhmien esterisidoksella. Siten nukleiinihappo on pentoosifosfaattipolymeeri, jossa on typpipitoisia emäksiä sivusubstituentteina. RNA-ketjun kemiallinen koostumus eroaa DNA:sta siten, että ensimmäinen koostuu hiilihydraattiriboosin viisijäsenisestä renkaasta, kun taas jälkimmäinen koostuu riboosin dehydroksiriboosijohdannaisesta. Lisäksi spatiaalisesti nämä molekyylit eroavat radikaalisti, koska RNA on joustava yksijuosteinen molekyyli, kun taas DNA on kaksijuosteinen molekyyli.

Proteiinit ovat lineaarisia polymeerejä, jotka ovat alfa-aminohappoketjuja, jotka on liitetty toisiinsa peptidisidoksilla, mistä johtuu niiden toinen nimi - polypeptidit. Luonnolliset proteiinit sisältävät monia erilaisia ​​aminohappoyksiköitä – ihmisillä jopa 20 – mikä määrää näiden molekyylien monenlaisia ​​toiminnallisia ominaisuuksia. Tietyt proteiinit osallistuvat lähes kaikkiin kehon prosesseihin ja suorittavat monia tehtäviä: ne toimivat solujen rakennusmateriaalina, kuljettavat aineita ja ioneja, katalysoivat kemiallisia reaktioita - tämä luettelo on hyvin pitkä. Proteiinit muodostavat stabiileja molekyylikonformaatioita eri organisaatiotasoilla (sekundaari- ja tertiääriset rakenteet) ja molekyylikomplekseja, mikä entisestään laajentaa niiden toiminnallisuutta. Näillä molekyyleillä voi olla korkea spesifisyys tiettyjen tehtävien suorittamiseen monimutkaisen spatiaalisen pallomaisen rakenteen muodostumisen vuoksi. Proteiinien laaja valikoima takaa tutkijoiden jatkuvan kiinnostuksen tämäntyyppisiä molekyylejä kohtaan.

Nykyaikaiset ajatukset molekyylibiologian aiheesta perustuvat yleistykseen, jonka Francis Crick esitti ensimmäisen kerran vuonna 1958 molekyylibiologian keskeisenä dogmana. Sen ydin oli väite, että geneettinen informaatio elävissä organismeissa käy läpi tiukasti määritellyt toteutusvaiheet: kopiointi DNA:sta DNA:han perinnön sisääntulossa, DNA:sta RNA:han ja sitten RNA:sta proteiiniin, eikä käänteinen siirtyminen ole mahdollista. Tämä väite oli vain osittain totta, joten keskeistä dogmaa korjattiin myöhemmin esiin tulleita uusia tietoja silmällä pitäen.

Tällä hetkellä tunnetaan useita tapoja realisoida geneettistä materiaalia, jotka edustavat erilaisia ​​​​sekvenssejä kolmesta geneettisen tiedon olemassaolon tyypistä: DNA, RNA ja proteiini. Yhdeksässä mahdollisessa toteutustavassa erotetaan kolme ryhmää: nämä ovat kolme yleistä muutosta (yleistä), joita esiintyy normaalisti useimmissa elävissä organismeissa; kolme erityistä transformaatiota (erityinen), jotka suoritetaan joissakin viruksissa tai erityisissä laboratorio-olosuhteissa; kolme tuntematonta muunnosa (tuntematon), joiden toteuttamista pidetään mahdottomaksi.

Yleiset muunnokset sisältävät seuraavat tavat toteuttaa geneettinen koodi: DNA → DNA (replikaatio), DNA → RNA (transkriptio), RNA → proteiini (translaatio).

Perinnöllisten ominaisuuksien siirtämiseksi vanhempien on siirrettävä täydellinen DNA-molekyyli jälkeläisilleen. Prosessia, jolla alkuperäisestä DNA:sta voidaan syntetisoida tarkka kopio ja siten siirtää geneettistä materiaalia, kutsutaan replikaatioksi. Sen suorittavat erityiset proteiinit, jotka purkavat molekyylin (oikaisevat sen osan), purkavat kaksoiskierteen ja luovat DNA-polymeraasin avulla tarkan kopion alkuperäisestä DNA-molekyylistä.

Solun elämän varmistamiseksi sen on jatkuvasti viitattava DNA:n kaksoiskierteeseen upotettuun geneettiseen koodiin. Tämä molekyyli on kuitenkin liian suuri ja kömpelö käytettäväksi suorana geneettisen materiaalin lähteenä jatkuvaan proteiinisynteesiin. Siksi DNA:n sisältämän tiedon toteuttamisprosessissa on välivaihe: mRNA:n synteesi, joka on pieni yksijuosteinen molekyyli, joka on komplementaarinen tiettyä proteiinia koodaavalle DNA-segmentille. Transkriptioprosessi suoritetaan RNA-polymeraasin ja transkriptiotekijöiden avulla. Tuloksena oleva molekyyli voidaan sitten helposti kuljettaa proteiinisynteesistä vastaavaan solun osaan - ribosomiin.

Sen jälkeen kun RNA on saapunut ribosomiin, alkaa geneettisen tiedon täytäntöönpanon viimeinen vaihe. Tässä tapauksessa ribosomi lukee geneettisen koodin mRNA:sta kodoneiksi kutsuttuina tripletteinä ja syntetisoi vastaavan proteiinin vastaanotetun tiedon perusteella.

Erityisten transformaatioiden aikana geneettinen koodi toteutetaan kaavion mukaisesti RNA→RNA (replikaatio), RNA→DNA (käänteistranskriptio), DNA→proteiini (suora translaatio). Tämän tyyppinen replikaatio tapahtuu monissa viruksissa, joissa sen suorittaa RNA-riippuvainen RNA-polymeraasientsyymi. Samanlaisia ​​entsyymejä löytyy eukaryoottisoluista, joissa ne liittyvät RNA:n hiljennysprosessiin. Käänteistranskriptiota löytyy retroviruksista, joissa se tapahtuu käänteiskopioijaentsyymin vaikutuksesta, ja joissain tapauksissa myös eukaryoottisoluissa, esimerkiksi telomeerisynteesin aikana. Suora lähetys suoritetaan vain keinotekoisissa olosuhteissa eristetyssä järjestelmässä solun ulkopuolella.

Mitä tahansa kolmesta mahdollisesta geneettisen tiedon siirtymisestä proteiinista proteiiniin, RNA:han tai DNA:han pidetään mahdottomana. Tapaus prionien vaikutuksesta proteiineihin, jonka seurauksena samanlainen prioni muodostuu, voidaan ehdollisesti katsoa geneettisen informaation proteiinin → proteiinin toteutustyypiksi. Muodollisesti se ei kuitenkaan ole sellainen, koska se ei vaikuta proteiinin aminohapposekvenssiin.

Käsitteen "keskusdogma" alkuperähistoria on mielenkiintoinen. Koska sana dogma tarkoittaa yleisesti väitettä, jota ei ole epäilty ja sanalla itsessään on selkeät uskonnolliset konnotaatiot, sen valinta tieteellisen tosiasian kuvaukseksi ei ole täysin oikeutettu. Francis Crickin itsensä mukaan tämä oli hänen virheensä. Hän halusi antaa ehdotetulle teorialle suuremman merkityksen, erottaa sen muista teorioista ja hypoteeseista; Miksi hän päätti käyttää tätä majesteettista, hänen mielestään sanaa ymmärtämättä sen todellista merkitystä? Nimi jäi kuitenkin kiinni.

Molekyylibiologia tänään

Molekyylibiologian nopea kehitys, jatkuva yleinen kiinnostus alan edistystä kohtaan ja tutkimuksen objektiivinen merkitys ovat johtaneet siihen, että ympäri maailmaa on syntynyt suuri määrä suuria molekyylibiologian tutkimuskeskuksia. Suurimmista mainittakoon seuraavat: Laboratory of Molecular Biology Cambridgessa, Royal Institution Lontoossa - Isossa-Britanniassa; molekyylibiologian instituutit Pariisissa, Marseillessa ja Strasbourgissa, Pasteur-instituutti - Ranskassa; molekyylibiologian laitokset Harvardin yliopistossa ja Massachusetts Institute of Technologyssa, Berkeleyn yliopistossa, California Institute of Technologyssa, Rockefeller Universityssä ja Bethesda Institute of Healthissa - Yhdysvalloissa; Max Planck -instituutit, Göttingenin ja Münchenin yliopistot, Berliinin molekyylibiologian keskusinstituutti, Jenan ja Hallen instituutit - Saksassa; Karolinska Institutet Tukholmassa Ruotsissa.

Venäjällä tämän alan johtavat keskukset ovat nimetty molekyylibiologian instituutti. V.A. Engelhardt RAS, Institute of Molecular Genetics RAS, Institute of Gene Biology RAS, Institute of Physical and Chemical Biology nimetty. A. N. Belozersky Moskovan valtionyliopisto on nimetty. M.V. Lomonosov, Biokemian instituutti. A.N.Bach RAS ja Protein RAS -instituutti Pushchinossa.

Nykyään molekyylibiologien intressit kattavat laajan kirjon tieteellisiä peruskysymyksiä. Johtava rooli on edelleen nukleiinihappojen rakenteen ja proteiinien biosynteesin tutkiminen, erilaisten solunsisäisten rakenteiden ja solupintojen rakenteen ja toiminnan tutkimukset. Tärkeitä tutkimusalueita ovat myös vastaanotto- ja signaalinvälitysmekanismien, yhdisteiden kuljetusmekanismien molekyylien tutkiminen solun sisällä sekä solusta ulkoiseen ympäristöön ja takaisin. Sovellettavan molekyylibiologian tieteellisen tutkimuksen pääsuuntauksista yksi tärkeimmistä prioriteeteista on kasvainten syntymisen ja kehityksen ongelma. Myös erittäin tärkeä alue, jota molekyylibiologian ala - molekyyligenetiikka tutkii, on perinnöllisten sairauksien ja virustautien, esimerkiksi AIDSin, esiintymisen molekyyliperustan tutkiminen sekä niiden menetelmien kehittäminen. ehkäisy ja mahdollisesti geenitason hoito. Molekyylibiologien löydöt ja kehitys oikeuslääketieteessä ovat löytäneet laajan sovelluksen. Venäjän, Yhdysvaltojen ja Ison-Britannian tutkijat tekivät 80-luvulla todellisen vallankumouksen henkilötunnistuksen alalla "genomisen sormenjälkien" - yksilön tunnistamisen DNA:n - menetelmän kehittämisen ja päivittämisen ansiosta. Tämän alan tutkimus ei lopu tähän päivään asti. Nykyaikaiset menetelmät mahdollistavat henkilön identiteetin määrittämisen prosentin miljardisosan virhetodennäköisyydellä. Geneettisen passin hankkeen aktiivinen kehittäminen on jo käynnissä, minkä odotetaan vähentävän rikollisuutta huomattavasti.

Metodologia

Nykyään molekyylibiologialla on laaja arsenaali menetelmiä, joiden avulla se voi ratkaista edistyneimmät ja monimutkaisimmat tutkijoiden kohtaamat ongelmat.

Yksi yleisimmistä menetelmistä molekyylibiologiassa on geelielektroforeesi, joka ratkaisee ongelman makromolekyylien seoksen erottamisesta koon tai varauksen mukaan. Lähes aina geelissä olevien makromolekyylien erottamisen jälkeen käytetään blottausta, menetelmää, joka mahdollistaa makromolekyylien siirtämisen geelistä (sorboitumisen) kalvon pinnalle niiden kanssa tehtävän jatkotyöskentelyn, erityisesti hybridisaation, helpottamiseksi. Hybridisaatio - hybridi-DNA:n muodostaminen kahdesta luonteeltaan eri ketjusta - on menetelmä, jolla on tärkeä rooli perustutkimuksessa. Sitä käytetään määrittämään täydentäviä segmenttejä eri DNA:ssa (eri lajien DNA), sitä käytetään uusien geenien etsimiseen, sen avulla löydettiin RNA-interferenssi ja sen periaate muodosti perustan genomisen sormenjälkien ottamiselle.

Tärkeä rooli molekyylibiologisen tutkimuksen nykyaikaisessa käytännössä on sekvensointimenetelmällä - nukleiinihappojen nukleotidien ja proteiineissa olevien aminohappojen sekvenssin määrittämisellä.

Nykyaikaista molekyylibiologiaa ei voida kuvitella ilman polymeraasiketjureaktiomenetelmää (PCR). Tämän menetelmän ansiosta tietyn DNA-sekvenssin kopioiden määrää lisätään (monistetaan), jotta yhdestä molekyylistä saadaan riittävä määrä ainetta sen kanssa jatkotyöskentelyyn. Samanlainen tulos saavutetaan molekyylikloonaustekniikalla, jossa vaadittu nukleotidisekvenssi viedään bakteerien (elävien järjestelmien) DNA:han, minkä jälkeen bakteerien lisääntyminen johtaa haluttuun tulokseen. Tämä lähestymistapa on teknisesti paljon monimutkaisempi, mutta sen avulla voidaan samanaikaisesti saada tulos tutkittavan nukleotidisekvenssin ilmentymisestä.

Myös molekyylibiologisessa tutkimuksessa käytetään laajasti ultrasentrifugointimenetelmiä (makromolekyylien (suurten määrien), solujen, organellien erottamiseen), elektroni- jaä, spektrofotometrisiä menetelmiä, röntgendiffraktioanalyysiä, autoradiografiaa jne.

Teknologisen kehityksen ja kemian, fysiikan, biologian ja tietojenkäsittelytieteen alan tieteellisen tutkimuksen ansiosta nykyaikaiset laitteet mahdollistavat yksittäisten geenien ja niihin liittyvien prosessien eristämisen, tutkimisen ja muuttamisen.

Nukleiinihappojen ja proteiinien biosynteesin tutkimuksen edistyminen on johtanut useiden menetelmien luomiseen, joilla on suuri soveltava merkitys lääketieteessä, maataloudessa ja useilla muilla teollisuudenaloilla.

Geneettisen koodin sekä perinnöllisen tiedon tallennuksen ja toteuttamisen perusperiaatteiden tutkimisen jälkeen molekyylibiologian kehitys pysähtyi, koska ei ollut menetelmiä, jotka olisivat mahdollistaneet geenien manipulointia, eristämistä ja muuttamista. Nämä menetelmät syntyivät 1970-1980-luvuilla. Tämä antoi voimakkaan sysäyksen tämän edelleen kukoistavan tieteenalan kehitykselle. Ensinnäkin nämä menetelmät liittyvät yksittäisten geenien saamiseen ja niiden viemiseen muiden organismien soluihin (molekyylikloonaus ja siirtogeneesi, PCR), sekä menetelmiä geenien nukleotidisekvenssin määrittämiseksi (DNA- ja RNA-sekvensointi). Alla näitä menetelmiä käsitellään tarkemmin. Aloitamme yksinkertaisimmalla perusmenetelmällä - elektroforeesilla ja siirrymme sitten monimutkaisempiin menetelmiin.

DNA ELEKTROFOREESI

Tämä on DNA:n kanssa työskentelyn perusmenetelmä, jota käytetään yhdessä lähes kaikkien muiden menetelmien kanssa haluttujen molekyylien eristämiseen ja tulosten analysointiin. Geelielektroforeesia käytetään DNA-fragmenttien erottamiseen pituuden mukaan. DNA on happo, sen molekyylit sisältävät fosforihappojäämiä, jotka poistavat protonin ja saavat negatiivisen varauksen (kuva 1).

Siksi sähkökentässä DNA-molekyylit liikkuvat kohti anodia - positiivisesti varautunutta elektrodia. Tämä tapahtuu elektrolyyttiliuoksessa, joka sisältää varauksia kuljettavia ioneja, jolloin liuos johtaa virtaa. Fragmenttien erottamiseen käytetään tiheää polymeereistä (agaroosista tai polyakryyliamidista) valmistettua geeliä. DNA-molekyylit "kietoutuvat" siihen mitä enemmän ne ovat pidempiä, ja siksi pisimmät molekyylit liikkuvat hitaimmin ja lyhyimmät nopeimmin (kuva 2). Ennen elektroforeesia tai sen jälkeen geeliä käsitellään väriaineilla, jotka sitoutuvat DNA:han ja fluoresoivat ultraviolettivalossa, ja geelissä saadaan vyöhykekuvio (katso kuva 3). Näytteen DNA-fragmenttien pituuksien määrittämiseksi niitä verrataan markkeriin - sarjaan standardipituisia fragmentteja, jotka levitetään rinnakkain samaan geeliin (kuvio 4).

Tärkeimmät työkalut DNA:n kanssa työskentelyyn ovat entsyymit, jotka suorittavat DNA-transformaatioita elävissä soluissa: DNA-polymeraasit, DNA-ligaasit ja restriktioendonukleaasit tai restrikaasit. DNA-polymeraasit suorittaa templaatti-DNA-synteesin, mikä mahdollistaa DNA:n lisääntymisen in vitro. DNA-ligaasit ompele DNA-molekyylejä yhteen tai korjaa niissä olevia aukkoja. Restriktioendonukleaasit, tai restriktioentsyymit, leikkaa DNA-molekyylejä tiukasti määriteltyjen sekvenssien mukaan, mikä mahdollistaa yksittäisten fragmenttien leikkaamisen DNA:n kokonaismassasta. Nämä fragmentit voivat joissakin tapauksissa sisältää yksittäisiä geenejä.

restriktioentsyymit

Restriktioentsyymien tunnistamat sekvenssit ovat symmetrisiä, ja katkoksia voi tapahtua sellaisen sekvenssin keskellä tai siirtymällä (samassa paikassa molemmissa DNA-juosteissa). Erityyppisten restriktioentsyymien toimintakaavio on esitetty kuvassa. 1. Ensimmäisessä tapauksessa saadaan ns. "tylpät" päät ja toisessa tapauksessa "tahmeat" päät. Pohjan "tahmeiden" päiden tapauksessa ketju osoittautuu toista lyhyemmäksi ja muodostuu yksijuosteinen alue, jolla on symmetrinen sekvenssi, sama molemmissa päissä.

Terminaaliset sekvenssit ovat samat, kun mikä tahansa DNA pilkotaan tietyllä restriktioentsyymillä, ja ne voidaan yhdistää uudelleen, koska niillä on komplementaarisia sekvenssejä. Ne voidaan silloittaa käyttämällä DNA-ligaasia yhden molekyylin muodostamiseksi. Tällä tavalla on mahdollista yhdistää kahden eri DNA:n fragmentteja ja saada ns yhdistelmä-DNA. Tätä lähestymistapaa käytetään molekyylikloonausmenetelmässä, joka mahdollistaa yksittäisten geenien hankkimisen ja viemisen soluihin, jotka voivat tehdä geenin koodaaman proteiinin.

molekyylikloonaus

Molekyylikloonaus käyttää kahta DNA-molekyyliä - inserttiä, joka sisältää kiinnostavan geenin, ja vektori- DNA toimii kantajana. Insertti "ommellaan" vektoriin entsyymeillä, jolloin saadaan uusi yhdistelmä-DNA-molekyyli, sitten tämä molekyyli viedään isäntäsoluihin, ja nämä solut muodostavat pesäkkeitä ravintoalustalle. Pesäke on yhden solun jälkeläinen, eli klooni, kaikki pesäkkeen solut ovat geneettisesti identtisiä ja sisältävät saman rekombinantti-DNA:n. Tästä johtuu termi "molekyylikloonaus", toisin sanoen meitä kiinnostavan DNA-fragmentin sisältävän solukloonin hankkiminen. Kun kiinnostuksen kohteena olevan insertion sisältävät pesäkkeet on saatu, insertio voidaan karakterisoida eri menetelmillä, esimerkiksi määrittämällä sen tarkka sekvenssi. Solut voivat myös tuottaa insertin koodaamaa proteiinia, jos se sisältää toiminnallisen geenin.

Kun rekombinanttimolekyyli viedään soluihin, tapahtuu näiden solujen geneettinen transformaatio. Muutos- prosessi, jossa organismin solu absorptioi ympäristöstä vapaan DNA-molekyylin ja integroituu genomiin, mikä johtaa DNA-luovuttajaorganismille tyypillisten uusien periytyvien ominaisuuksien esiintymiseen tällaisessa solussa. Esimerkiksi, jos lisätty molekyyli sisältää geenin, joka on vastustuskykyinen antibiootille ampisilliinille, transformoidut bakteerit kasvavat sen läsnä ollessa. Ennen transformaatiota ampisilliini aiheutti heidän kuolemansa, eli transformoituneisiin soluihin ilmestyy uusi ominaisuus.

VEKTORIT

Vektorilla on oltava useita ominaisuuksia:

Ensinnäkin se on suhteellisen pieni DNA-molekyyli, joten sitä voidaan helposti manipuloida.

Toiseksi, jotta DNA säilyisi ja lisääntyisi solussa, sen on sisällettävä tietty sekvenssi, joka varmistaa sen replikaation (replikaation alkuperä tai replikaation aloituskohta).

Kolmanneksi sen on sisällettävä markkerigeeni, joka varmistaa vain niiden solujen valinnan, joihin vektori on tullut. Yleensä nämä ovat antibioottiresistenssigeenejä - sitten antibiootin läsnä ollessa kaikki solut, jotka eivät sisällä vektoria, kuolevat.

Geenikloonaus suoritetaan useimmiten bakteerisoluissa, koska niitä on helppo viljellä ja lisääntyä nopeasti. Bakteerisolussa on yleensä yksi suuri, useita miljoonia nukleotidipareja pitkä pyöreä DNA-molekyyli, joka sisältää kaikki bakteerille tarpeelliset geenit - bakteerin kromosomi. Sen lisäksi joissakin bakteereissa on pieniä (useita tuhansia emäspareja) pyöreä DNA ns plasmidit(Kuva 2). Ne, kuten pää-DNA, sisältävät nukleotidisekvenssin, joka varmistaa DNA:n kyvyn replikoitua (ori). Plasmidit replikoituvat pääasiallisesta (kromosomaalisesta) DNA:sta riippumatta, joten niitä on solussa suuri määrä kopioita. Monet näistä plasmideista sisältävät antibioottiresistenssigeenejä, minkä ansiosta plasmidia kantavat solut voidaan erottaa normaaleista soluista. Useammin käytetään plasmideja, joissa on kaksi geeniä, jotka tarjoavat resistenssin kahdelle antibiootille, esimerkiksi tetrasykliinille ja amisilliinille. On olemassa yksinkertaisia ​​menetelmiä sellaisen plasmidi-DNA:n eristämiseksi, joka on vapaa bakteerin pääkromosomin DNA:sta.

TRANGENEESIIN MERKITYS

Geenien siirtymistä organismista toiseen kutsutaan transgeneesi ja sellaiset muunnetut organismit - siirtogeeninen. Geeninsiirtomenetelmä mikrobisoluihin tuottaa rlääketieteellisiin tarpeisiin, erityisesti ihmisen proteiineja, jotka eivät aiheuta immuunihyljintää - interferoneja, insuliinia ja muita proteiinihormoneja, solujen kasvutekijöitä sekä proteiineja rokotteiden valmistukseen. Monimutkaisemmissa tapauksissa, kun proteiinien modifikaatio tapahtuu oikein vain eukaryoottisoluissa, käytetään siirtogeenisiä soluviljelmiä tai siirtogeenisiä eläimiä, erityisesti karjaa (pääasiassa vuohia), jotka erittävät tarvittavat proteiinit maitoon, tai proteiineja eristetään niiden verestä. Näin saadaan vasta-aineita, veren hyytymistekijöitä ja muita proteiineja. Transgeneesimenetelmällä saadaan viljeltyjä kasveja, jotka ovat resistenttejä rikkakasvien torjunta-aineille ja tuholaisille ja joilla on muita hyödyllisiä ominaisuuksia. Siirtogeenisiä mikro-organismeja käytetään puhdistamaan jätevettä ja torjumaan saastumista. On jopa siirtogeenisiä mikrobeja, jotka voivat hajottaa öljyä. Lisäksi siirtogeeniset teknologiat ovat välttämättömiä tieteellisessä tutkimuksessa - biologian kehitystä ei nykyään voida ajatella ilman modifiointi- ja geeninsiirtomenetelmien rutiininomaista käyttöä.

molekyylikloonaustekniikka

insertit

Yksittäisen geenin saamiseksi organismista eristetään siitä kaikki kromosomaalinen DNA ja pilkotaan yhdellä tai kahdella restriktioentsyymillä. Entsyymit valitaan siten, että ne eivät leikkaa meitä kiinnostavaa geeniä, vaan tekevät katkoja sen reunoille ja plasmidi-DNA:ssa ne tekevät 1 katkaisun johonkin resistenssigeeniin, esimerkiksi ampisilliinille.

Molekyylikloonausprosessi sisältää seuraavat vaiheet:

Leikkaus ja ompeleminen on yhden rekombinanttimolekyylin rakentamista insertistä ja vektorista.

Transformaatio on rekombinanttimolekyylin viemistä soluihin.

Valinta on sellaisten solujen valinta, jotka ovat vastaanottaneet vektorin, jossa on insertti.

leikkaus ja ompeleminen

Plasmidi-DNA:ta käsitellään samoilla restriktioentsyymeillä ja se muunnetaan lineaariseksi molekyyliksi, jos valitaan restriktioentsyymi, joka tuo 1 katkaisun plasmidiin. Tämän seurauksena kaikki tuloksena olevat DNA-fragmentit päätyvät samoihin tahmeisiin päihin. Kun lämpötila laskee, nämä päät kytkeytyvät satunnaisesti ja silloitetaan DNA-ligaasilla (katso kuvio 3).

Saadaan sekoitus koostumukseltaan erilaista pyöreää DNA:ta: osa niistä sisältää tietyn kromosomaalisen DNA:n DNA-sekvenssin, joka on yhdistetty bakteeri-DNA:han, toiset sisältävät kromosomaalisen DNA:n fragmentteja toisiinsa liittyneenä ja toiset sisältävät palautetun pyöreän plasmidin tai sen dimeerin ( kuva 4).

muunnos

Seuraavaksi tämä seos suoritetaan geneettinen transformaatio bakteerit, jotka eivät sisällä plasmideja. Muutos- prosessi, jossa organismin solu absorptioi ympäristöstä vapaan DNA-molekyylin ja integroituu genomiin, mikä johtaa DNA-luovuttajaorganismille tyypillisten uusien periytyvien ominaisuuksien esiintymiseen tällaisessa solussa. Vain yksi plasmidi voi tunkeutua ja lisääntyä jokaisessa solussa. Tällaiset solut asetetaan kiinteälle ravintoalustalle, joka sisältää antibiootti tetrasykliiniä. Solut, jotka eivät ole saaneet plasmidia, eivät kasva tällä alustalla, ja plasmidia kantavat solut muodostavat pesäkkeitä, joista jokainen sisältää vain yhden solun jälkeläisiä, ts. kaikki pesäkkeen solut kantavat samaa plasmidia (katso kuvio 5).

Valinta

Seuraava tehtävä on eristää vain solut, jotka sisältävät vektorin insertin kanssa, ja erottaa ne soluista, joissa on vain vektori ilman inserttiä tai jotka eivät sisällä vektoria ollenkaan. Tätä haluttujen solujen valintaprosessia kutsutaan valinta. Tätä tarkoitusta varten he käyttävät selektiiviset merkit- yleensä antibioottiresistenssigeenit vektorissa, ja valikoiva media, jotka sisältävät antibiootteja tai muita selektiivisiä aineita.

Tarkastelemassamme esimerkissä ampisilliinin läsnä ollessa kasvatetuista pesäkkeistä peräisin olevat solut jatkoviljellään kahteen alustaan: ensimmäinen sisältää ampisilliinia ja toinen tetrasykliiniä. Pesäkkeet, jotka sisältävät vain plasmidin, kasvavat molemmilla elatusaineilla, mutta pesäkkeet, joiden plasmidit sisältävät upotetun kromosomaalisen DNA:n, eivät kasva tetrasykliiniä sisältävällä alustalla (kuvio 5). Niistä valitaan erityisillä menetelmillä ne, jotka sisältävät meitä kiinnostavan geenin, kasvatetaan riittävästi ja eristetään plasmidi-DNA. Siitä leikataan pois kiinnostava yksittäinen geeni käyttämällä samoja restriktioentsyymejä, joita käytettiin rekombinantti-DNA:n saamiseksi. Tämän geenin DNA:ta voidaan käyttää nukleotidisekvenssin määrittämiseen, sen viemiseen mihin tahansa organismiin uusien ominaisuuksien saamiseksi tai halutun proteiinin syntetisoimiseen. Tätä geenieristysmenetelmää kutsutaan molekyylikloonaus.

fluoresoivat proteiinit

On erittäin kätevää käyttää fluoresoivia proteiineja markkerigeeneinä eukaryoottisten organismien tutkimuksissa. Ensimmäisen fluoresoivan proteiinin geeni, vihreä fluoresoiva proteiini (GFP) eristettiin meduusasta Aqeuorea victoria ja vietiin erilaisiin mallieliöihin (katso kuva 6). Vuonna 2008 O. Shimomura, M. Chalfie ja R. Tsien saivat Nobel-palkinnon tämän proteiinin löytämisestä ja soveltamisesta.

Sitten eristettiin muiden fluoresoivien proteiinien - punaisen, sinisen, keltaisen - geenit. Näitä geenejä on modifioitu keinotekoisesti tuottamaan proteiineja, joilla on halutut ominaisuudet. Fluoresoivien proteiinien monimuotoisuus on esitetty kuvassa. 7, jossa on petrimalja, jossa on bakteereja, jotka sisältävät geenejä eri fluoresoiville proteiineille.

fluoresoivien proteiinien käyttö

Fluoresoivan proteiinin geeni voidaan fuusioida minkä tahansa muun proteiinin geeniin, jolloin translaation aikana muodostuu yksittäinen proteiini - translaatiofuusioproteiini tai fuusio(fuusioproteiini), joka fluoresoi. Tällä tavoin voidaan tutkia esimerkiksi minkä tahansa kiinnostavan proteiinin sijaintia (sijaintia) solussa ja niiden liikkumista. Ilmentämällä fluoresoivia proteiineja vain tietyntyyppisissä soluissa on mahdollista merkitä tämän tyyppisiä soluja monisoluisessa organismissa (katso kuva 8 - hiiren aivot, joissa yksittäisillä hermosoluilla on eri värit fluoresoivien proteiinigeenien spesifisen yhdistelmän vuoksi) . Fluoresoivat proteiinit ovat välttämätön työkalu nykyaikaisessa molekyylibiologiassa.

PCR

Toista menetelmää geenien saamiseksi kutsutaan polymeraasiketjureaktio (PCR). Se perustuu DNA-polymeraasien kykyyn täydentää DNA:n toinen juoste komplementaarista juostetta pitkin, kuten tapahtuu soluissa DNA:n replikaation aikana.

Tämän menetelmän replikaation alkukohdat määritetään kahdella pienellä DNA-palalla, joita kutsutaan siemenet, tai alukkeet. Nämä alukkeet ovat komplementaarisia kiinnostuksen kohteena olevan geenin päille kahdessa DNA-juosteessa. Ensin kromosomaalinen DNA, josta geeni on eristettävä, sekoitetaan alukkeiden kanssa ja kuumennetaan 99 o C:een. Tämä johtaa vetysidosten katkeamiseen ja DNA-säikeiden hajoamiseen. Tämän jälkeen lämpötila lasketaan 50-70 o C:een (riippuen siementen pituudesta ja järjestyksestä). Näissä olosuhteissa alukkeet kiinnittyvät kromosomaalisen DNA:n komplementaarisiin alueisiin muodostaen säännöllisen kaksoiskierteen (katso kuvio 9). Tämän jälkeen lisätään kaikkien neljän DNA-synteesiin tarvittavan nukleotidin ja DNA-polymeraasin seos. Entsyymi laajentaa alukkeita rakentaen kaksijuosteista DNA:ta alukkeiden kiinnittymiskohdasta, ts. geenin päistä yksijuosteisen kromosomaalisen molekyylin loppuun.

Jos lämmität seosta nyt uudelleen, kromosomaaliset ja vasta syntetisoidut ketjut erottuvat. Jäähtymisen jälkeen ne yhdistyvät jälleen siemenillä, joita otetaan runsaasti (katso kuva 10).

Äskettäin syntetisoiduissa ketjuissa ne eivät liity siihen päähän, josta ensimmäinen synteesi alkoi, vaan vastakkaiseen päähän, koska DNA-ketjut ovat vastakkaisia. Siksi toisessa synteesisyklissä vain geeniä vastaava sekvenssi valmistuu tällaisissa ketjuissa (katso kuvio 11).

Tässä menetelmässä käytetään termofiilisten bakteerien DNA-polymeraasia, joka kestää kiehumista ja toimii 70-80 o C:n lämpötiloissa, sitä ei tarvitse lisätä joka kerta, vaan se on lisättävä kokeen alussa. Toistamalla lämmitys- ja jäähdytystoimenpiteet samassa järjestyksessä, voimme kaksinkertaistaa jaksojen määrän kussakin jaksossa, jota molemmista päistä rajoittavat lisätyt siemenet (katso kuva 12).

Noin 25 tällaisen syklin jälkeen geenin kopioiden määrä kasvaa yli miljoona kertaa. Tällaiset määrät voidaan helposti erottaa koeputkeen lisätystä kromosomaalisesta DNA:sta ja käyttää eri tarkoituksiin.

DNA-sekvensointi

Toinen tärkeä saavutus on menetelmien kehittäminen DNA:n nukleotidisekvenssin määrittämiseksi - DNA-sekvensointi(englanninkielisestä sekvenssistä - sekvenssi). Tätä varten on tarpeen saada geenit puhtaina toisesta DNA:sta jollakin kuvatuista menetelmistä. DNA-juosteet erotetaan sitten kuumentamalla ja lisätään radioaktiivisella fosforilla leimattu aluke tai fluoresoiva leima. Huomaa, että otetaan yksi pohjamaali, joka täydentää yhtä säiettä. Sitten lisätään DNA-polymeraasi ja 4 nukleotidin seos. Tämä seos jaetaan 4 osaan ja jokaiseen lisätään yksi nukleotideista modifioituna siten, että deoksiriboosin kolmas atomi ei sisällä hydroksyyliryhmää. Jos sellainen nukleotidi sisältyy syntetisoitavaan DNA-ketjuun, sen pidentyminen ei voi jatkua, koska polymeraasilla ei ole minnekään kiinnittää seuraavaa nukleotidia. Siksi DNA-synteesi pysähtyy tällaisen nukleotidin sisällyttämisen jälkeen. Näitä nukleotideja, joita kutsutaan dideoksinukleotideiksi, lisätään huomattavasti vähemmän kuin normaaleja, joten ketjun päättyminen tapahtuu vain satunnaisesti ja eri paikoissa kussakin ketjussa. Tuloksena on sekoitus eripituisia ketjuja, joista jokaisen päässä on sama nukleotidi. Siten ketjun pituus vastaa nukleotidin lukumäärää tutkittavassa sekvenssissä, esimerkiksi jos meillä oli adenyylidideoksinukleotidi ja tuloksena saadut ketjut olivat pituudeltaan 2, 7 ja 12 nukleotidia, niin siinä oli adeniinia. geenin toinen, seitsemäs ja kahdestoista asema. Tuloksena oleva ketjuseos voidaan helposti erottaa koon mukaan elektroforeesilla, ja syntetisoidut ketjut voidaan tunnistaa radioaktiivisuudella röntgenfilmillä (katso kuva 10).

Tuloksena on kuvan alareunassa oleva kuva, jota kutsutaan nimikirjoitukseksi. Liikkumalla sitä pitkin alhaalta ylös ja lukemalla kunkin vyöhykkeen sarakkeiden yläpuolella olevan kirjaimen, saamme nimikirjoituksen oikealla puolella olevassa kuvassa näkyvän nukleotidisekvenssin. Kävi ilmi, että synteesiä pysäyttävät dideoksinukleotidien lisäksi myös nukleotidit, joissa jokin kemiallinen ryhmä, esimerkiksi fluoresoiva väriaine, on kiinnittynyt sokerin kolmanteen paikkaan. Jos jokainen nukleotidi on leimattu omalla väriaineella, syntetisoidut ketjut erotettaessa saadut vyöhykkeet hehkuvat eri valolla. Tämä mahdollistaa reaktion suorittamisen yhdessä koeputkessa samanaikaisesti kaikille nukleotideille ja jakamalla saadut ketjut pituuden mukaan, tunnistaa nukleotidit värin perusteella (katso kuva 11).

Tällaiset menetelmät mahdollistivat yksittäisten geenien sekvenssien määrittämisen, mutta myös kokonaisten genomien lukemisen. Tällä hetkellä on kehitetty entistä nopeampia menetelmiä geenien nukleotidisekvenssien määrittämiseen. Jos ensimmäinen ihmisgenomi selvitettiin suuressa kansainvälisessä konsortiossa ensimmäisellä annetulla menetelmällä 12 vuodessa, toisella, toisella kolmessa vuodessa, nyt tämä voidaan tehdä kuukaudessa. Näin voidaan ennustaa ihmisen alttius monille sairauksille ja ryhtyä toimenpiteisiin niiden välttämiseksi.