Vnos radioaktivne oznake v biološke pripravke

Avtoradiografija

Glavni namen avtoradiografije je registracija pasov radioaktivno označenih zdravil (proteinov in NK) po elektroforezi. V ta namen se uporablja medicinski "nezaščiten" rentgenski film (filmi z zaščitno plastjo na površini absorbirajo del sevanja). Črnitev rentgenskega filma (po razvijanju) se pojavi tako pod vplivom elektronov kot y-sevanja. Označena zdravila tritij, zaradi njegove majhne prodorne sposobnosti (3-elektronov) ga lahko s to metodo posnamemo le pri zelo visokih jakostih sevanja Avtoradiografijo preparatov označenih s S in C izvajamo dokaj uspešno Vendar PAGE plošče v ti primeri morajo biti pred snemanjem radioaktivnosti popolnoma posušeni.V nasprotnem primeru R-elektroni, ki se oddajajo v globino gela, ne bodo dosegli filma.Gel posušite tako, da ga položite na debel filtrirni papir (pri sušenju se lepi in se ne skrči), 1 -2 uri v vakuumu in s segrevanjem ali 36 ur na zraku pri sobni temperaturi - do stanja tankega, močnega in prozornega filma. Ni pa priporočljivo, da debelina mokrega gela presega 0,4 mm.

Rentgenski film se nanese kot emulzija neposredno na gel. V tej eksperimentalni postavitvi P-elektroni ogljika in žvepla prodrejo v emulzijsko plast do globine približno 0,25 mm. Da bi zagotovili dobro prileganje filma na gel, je pod pokrovom ustrezne kasete nameščeno gobasto gumijasto tesnilo z vzmetnimi sponkami. Sama kaseta je ovita v črn papir. Razstava traja več dni. Nato sledi, kot običajno, manifestacija in fiksacija.

Energija P-sevanja radioaktivnega fosforja je dovolj visoka, da lahko avtoradiografijo izvedemo neposredno iz plošče z mokrim gelom. Gel, prekrit s filmom, pustimo na eni od steklenih plošč, zavijemo v tanek polietilen in izpostavimo, kot je opisano zgoraj, nekaj ur - po možnosti na hladnem (-20°), da preprečimo trakove v gelu. pred širjenjem med izpostavljenostjo zaradi difuzije. Elektroni P iz radioaktivnega fosforja lahko potujejo skozi material rentgenskega filma do globine 6 mm. To pomeni, da jih večina "prelukne" film, ne da bi vso svojo energijo prenesla na molekule srebrovega bromida in zato niso posneti najbolje. Včasih, če je intenzivnost P-sevanja nizka (zaradi nizke vsebnosti), se ti "zapravljeni" elektroni ujamejo s fosforescentnim zaslonom, ki je nameščen na drugi strani filma. P-elektroni, ki zadenejo zaslon, povzročijo, da zasije, film pa zabeleži (ne brez zamegljenosti slike) tudi svetleč trak na zaslonu. Toda svetlost črnitve v tem primeru se lahko poveča za 5-8 krat.

Ker je pri uporabi zaslonske fluorescence možna sprostitev kristalov srebrovega bromida, ki so razpadli pod vplivom svetlobe, je bolje, da film v tem primeru izpostavimo pri -70°.

Da bi zagotovili pravilno poravnavo filma po razvijanju z originalnim gelom, se na njem pred avtoradiografijo v vogalih naredita dve oznaki z radioaktivnim črnilom.

Scintilacijski števci sevanja

Avtoradiografska metoda ima dve resni slabosti. Prvič, nemogoče je količinsko opredeliti intenzivnost radioaktivnega sevanja. Stopnja črnitve prog je za to pregrobo merilo. Drugič, v mnogih primerih je praktično nemogoče zaznati sevanje tritija z uporabo avtoradiografije

Obe pomanjkljivosti sta odpravljeni pri uporabi tekočih scintilacijskih števcev. Ideja je raztopiti radioaktivno označeno snov v tekočini, ki bi se odzvala s svetlobnimi bliski, ko bi bila izpostavljena P-elektronom, ki imajo celo relativno nizko energijo. Te bliske lahko zaznajo zelo občutljive fotocelice. Ta tekočina se imenuje scintilator. , in sami bliski so scintilacije. Načelo delovanja tukaj je preprosto. Elektron, izdan iz jedra radioaktivnega atoma, ki je del določene biološke molekule, nemudoma vstopi v tekoči medij, kjer je obsojen na trk na poti svojega leta (tudi če se meri le z delčki milimetra). ) z molekulami scitilatorja. Precejšen del takšnih trkov bo privedel do prenosa dela kinetične energije elektrona na nek "zlahka vzdražljiv" zunanji elektron scintilatorja. Najverjetneje je elektron, ki sodeluje pri izvajanju konjugiranih dvojnih vezi v aromatski molekuli, npr. toluen oz naftalin. Običajna "življenjska doba" takega elektrona v vzbujenem stanju je približno 10 ~ 8 sekund, po kateri se vrne v svoj običajni položaj in odda nastalo "dodatno" energijo z oddajanjem svetlobnega kvanta.

Elektroni letijo zelo hitro. Zato bodo intervali med pojavom fotonov (na poti elektrona) tako majhni, da ne le človeško oko (če bi bila ta svetloba v vidnem območju), temveč tudi elektronske snemalne naprave to verigo bliskov zaznajo kot eno. svetlobni utrip. Koliko radioaktivnih razpadov v zdravilu se bo zgodilo v 1 minuti, tj. Koliko elektronov sledi svoji poti v scitilatorju na minuto, toliko električnih impulzov bo zabeležil zelo občutljiv števec sevanja.

Kot taki ne uporabljajo fotocelic (njihova občutljivost je prenizka), ampak fotopomnoževalne cevi(FEU). S temi napravami bi se morali seznaniti pri tečaju fizike. Ideja njihove naprave je, da je na koncu v cilindru, izpraznjenem v visok vakuum, fotokatoda, ki tudi ko vanjo zadene en sam foton, odda vsaj en elektron. Pod vplivom močnega električnega polja se ta elektron pospeši in udari v prvo "dinodo" - kovinsko ploščo, prevlečeno s posebno sestavo, ki se lahko "odzove" na udarec hitro letečega elektrona z oddajanjem približno 5 "sekundarnih" elektronov. . Vsi po vrsti so pospešeni z električnim poljem in udarijo v drugo dinodo. Iz katerega že odleti okoli 25 elektronov. To množenje števila elektronov poteka v 8-10 "kaskadah". Tako da na anodo, ki stoji na koncu valja, pade cel »plaz« elektronov, ki jih ustvari vsak zelo šibek in kratek blisk svetlobe. Plaz elektronov se zlahka pretvori v precej opazen in tako kratek kot prvi blisk svetlobe napetostni impulz. Sledi še ojačevalnik te napetosti in elektronski števec impulzov, ki uspe registrirati več tisoč impulzov na sekundo. Ob koncu določenega časa štetja (na primer 1 minuta) se števec ustavi in ​​prikaže končni rezultat štetja (v impulzih/min).

Zgoraj je bila podana izjava o omejitvi odgovornosti: "če bi bila ta svetloba vidna očem." Ni vidna, ker leži v ultravijoličnem območju. Tako daleč, da ga običajen fotopomnoževalec ne more registrirati. Toda kratkovalovno sevanje je mogoče zlahka pretvoriti v daljše valovne dolžine s pomočjo fosforjev – snovi, ki se na absorpcijo kratkih valovnih dolžin svetlobe odzovejo z oddajanjem daljših valov. Scintilatorju dodamo majhno količino (-0,5 %) fosforja, ki v dveh stopnjah, a v trenutku pretvori začetni blisk svetlobe z valovno dolžino okoli 310 Hz v blisk z valovno dolžino 420 mi, ki se dobro posname. s fotopomnoževalcem.

Zdi se, da je bila najdena metoda za beleženje energijsko šibke radioaktivnosti (3H) in oceno njene specifične aktivnosti (v štetjih/min), vendar se pojavljajo nekatere težave, ki jih je treba omeniti za premagovanje. Ni naključje, da sem toluen in naftalen zgoraj imenoval kot primarna scintilatorja. Prednost imajo zaradi več razlogov. Toda naftalen je trdna snov. Na srečo ga je mogoče raztopiti v dioksanu do koncentracije 6-10 mas.%. Toda dioksan se dobro meša z vodo in ne izgubi te sposobnosti, če se v njem raztopi naftalen. To je pomembno, saj večino bioloških zdravil proučujemo v obliki vodnih raztopin.

Dejstvo, da je v viali s scintilatorsko tekočino samo 10 % raztopljene snovi, strogo gledano scintilator, ne vpliva na učinkovitost štetja impulzov. "Posledičnih" trkov je še vedno precej, a se še vedno zlijejo v en sam svetlobni blisk. No, kaj pa scintilator na osnovi toluena? V tem primeru je vsa tekočina v viali primarni scintilator, vendar... se ne meša z vodo. Težavo rešimo tako, da toluenu dodamo detergent Triton X-100 v razmerju 1:3 ali celo 1:2. Če količina vodne raztopine radioaktivnega zdravila ne presega 2,8 ml na 20 ml scintilatorja, dobimo pravo raztopino in učinkovitost štetja impulzov se praktično ne zmanjša.

Zdi se, da je problem rešen. Dovolj je, da enega od dveh scintilatorjev vlijete v steklenico s prostornino 25 ml, dodate vodno raztopino radioaktivno označenega biološkega pripravka v količini 2-2,5 ml, to steklenico postavite v popolno temo (v globino naprava, dobro zaščitena pred svetlobo) pred fotokatodo PMT in impulze je mogoče prešteti. Ampak tam ga ni bilo. Ker je včasih treba zelo natančno prešteti zelo majhne ravni radioaktivnosti, moti stalni "sovražnik" vseh zelo občutljivih elektronskih naprav - tako imenovani "notranji šum" elementov, ki tvorijo te naprave. Vključno s šumom fotopomnoževalnika. Fizikalni razlog za to je v dejstvu, da se elektroni iz fotokatode nenehno oddajajo, brez kakršne koli osvetlitve, temveč le zaradi svojih toplotnih gibanj, z visoko frekvenco in popolnoma kaotično. Močno električno polje jih takoj pobere, pomnoži, kot je opisano zgoraj, in proizvede lažne, "temne" impulze napetosti, ki jih števec impulzov uspešno zabeleži. To »temno število« je lahko večkrat večje od števila zabeležene radioaktivnosti (doseže vrednost reda 105 impulzov/min). To je "plačilo" za visoko občutljivost!

Vendar je elektronika našla izhod iz te na videz brezupne situacije. Steklenička z zdravilom je nameščena med dve fotopomnoževalni cevi. Napetostni impulzi iz vsakega od njih se istočasno uporabljajo za elektronsko napravo, imenovano "vezje naključja". Na žalost nam šolski predmet fizike (bojim se, da tudi predmet biologije) ne omogoča opisati tega zelo preprostega, a čudovitega izuma. Vse, kar ostane, je poročati, kaj počne. Oddaja (v obliki enega samega impulza) v elektronsko vezje, ki mu sledita dva napetostna impulza, ki prispeta na njegova dva "vhoda" strogo istočasno - z natančnostjo 10 ~ 8 sekund. Omenil sem, da fotopomnoževalci povzročajo hrup, čeprav z visoko stopnjo ponavljanja impulzov šuma, vendar kaotično. Zato je verjetnost, da bosta dva impulza hrupa prispela na vhode koincidenčnega vezja hkrati (z določeno natančnostjo), zelo majhna. Zaradi tega se število zabeleženih šumnih impulzov katastrofalno zmanjša - na 3-5 impulzov/min. In oba fotopomnoževalca "vidita" svetlobni blisk v scintilatorju in ga popolnoma istočasno registrirata!

Vendar pa obstajajo tudi drugi viri lažnega štetja utripa. Na primer kozmični žarki. Letijo skozi vialo scintilatorja in proizvedejo svetlobni blisk. Za zaščito pred njimi je steklenica, ki je spuščena v globino naprave za izračun, tam zaščitena z debelim svinčenim "oklepom".

Elektronika nam omogoča še en, nič manj izjemen rezultat. Če v scintilator hkrati vnesemo dve zdravili, od katerih je ena npr. , in drugo - radioaktivni ogljik, potem lahko sodoben 2-kanalni števec sevanja registrira eno in drugo radioaktivnost ločeno v svojih dveh kanalih. Tukaj se igra razlika v amplitudah impulzov tritijevega in ogljikovega izvora. Izhaja iz razlike v energijah P-elektronov in s tem iz razlike v svetlosti ustreznih svetlobnih bliskov. Ta razlika se pretvori v razliko v amplitudah začetnih napetostnih impulzov, vzetih iz anod obeh fotopomnoževalcev. Na vhodu vsi Od dveh števcev (po skupnem napetostnem predojačevalniku) sta dva tako imenovana "omejevalca praga". Eden od njih (»zgornji prag«) ne dovoljuje, da napetostni impulzi preidejo na merilnik, katerega velikost več neko vnaprej določeno vrednost. Drugi (»spodnji prag«) »odseka« vse impulze, ki manj drugo, prav tako vnaprej določeno vrednost. Vse te štiri omejevalnike (v 2 kanalih) nastavi eksperimentator glede na to, kateri par izotopov se izračunava. Zaradi te prilagoditve en kanal za štetje sprejema impulze samo od močnejšega oddajnika, drugi pa le od šibkega. Prilagoditev upošteva tudi neizogibno delno prekrivanje energijskih porazdelitev za elektrone P iz obeh virov. V ta namen je porazdelitev za impulze velike moči delno "odrezana" od spodaj - s strani impulzov manjše amplitude. In registracija šibkih impulzov je omejena "od zgoraj" - nekateri "najvišji" impulzi te kategorije ne prehajajo. Posledično je štetje števila impulzov obeh kategorij nekoliko podcenjeno, vendar se izkaže, da sta ločena v različne kanale. Naprava samodejno naredi korekcijske faktorje za takšno podcenjevanje, tako da predhodno izračuna (pri določenih pragovih) referenčne vzorce vsake od obeh uporabljenih vrst radioaktivnosti. Rezultati so natisnjeni na traku v ločenih stolpcih.

Z uporabo večdelne verige kovinskih vtičnic lahko v avtomatsko napravo namestite do dvesto oštevilčenih vial, ki se zaporedno štejejo brez posredovanja operaterja (na primer ponoči).

Na sl. Slika 1 prikazuje shematski električni diagram 2-kanalnega števca sevanja. Oznake: 1 - steklenica z zdravilom, 2 - PMT, 3 - vezje naključja, 4 - napetostni ojačevalnik, 5 - spodnji pragovi, 6 - zgornji pragovi, 7 - števci števila impulzov za kanale A in B.

Štetje radioaktivnosti na filtrih

Če se sinteza beljakovin ali nukleinskih kislin izvaja v celotnem encimskem sistemu v vitro(in vitro) z uporabo radioaktivno označenih prekurzorjev z nizko molekulsko maso, nato pa je mogoče vključitev radioaktivnosti v biopolimer oceniti s filtrirnim številom končnega produkta. Za zadrževanje proteinov ali nukleinskih kislin, potem ko so bili oborjeni iz reakcijske mešanice s trikloroocetno kislino (TCA) ali etanolom, lahko uporabimo filtre iz debelega filtrirnega papirja ali steklenih vlaken z velikostjo por 0,45-1,2 kg. Druga možnost vključuje uporabo komercialno dostopnih nitroceluloznih membranskih filtrov (nesedimentnih). V tem primeru je zadrževanje produkta reakcije na filtru posledica njegove sorpcije. Nitroceluloza trdno absorbira alkalne proteine, ribosome in enoverižne (denaturirane) molekule DNK. Pri tem velja opozoriti, da v primeru uporabe filtrov iz papirja ali steklenih vlaken del radioaktivnega produkta prodre globoko v filter, pri membranskem filtru pa se ves razporedi v tankem filmu po površini. Z vidika zanesljivega stika s scintilatorjem je boljša druga možnost. Toda membranski filtri so veliko dražji od papirnatih ali filtrov iz steklenih vlaken.

Za ta namen so primerni filtri s premerom 24 mm, ki jih je enostavno dodati v viale scintilacijskega števca. Filtracija se izvaja s preprosto napravo, prikazano na sliki 2.

V bučko (1) je na gumijastem zamašku vstavljen obročasti nosilec za filter (2) iz nerjavečega jekla v obliki rešetke z obročasto brušeno prirobnico. Nanj je nameščen filter (3), na filter pa je nameščen rezervoar (4), strojno izdelan iz istega jekla in prav tako z brušeno prirobnico. Prirobnice so stisnjene z vzmetnimi sponami (ni prikazano). Ta enostavno snemljiva oblika je priročna za manipulacijo filtra.

Reakcijsko zmes z usedlino preskušanega produkta, ki je v njej suspendirana (v prvi možnosti) ali brez usedline (v drugi možnosti), se vlije v rezervoar in tekočina sesa pod rahlim vakuumom. Radioaktivne prekurzorje izpiramo 5-6 krat, pri čemer nadomestimo čistilno tekočino v rezervoarju, ki ni sposobna raztopiti usedline. (Na primer isti, v katerem je bil odložen polimer)

Če je filtrov veliko, potem, ko jih najprej oštevilčite ob robu s svinčnikom, jih lahko operete "v prostornini", v velikih serijah, tako da pralno tekočino zamenjate vsakih 15 minut in jo občasno stresate. V vsakem primeru se zadnja izpiranja izvedejo z etanolom, nato z etrom, da se popolnoma odstrani voda med kasnejšim sušenjem filtrov. To je še posebej pomembno pri »razsutem«: papirnatih in steklenih filtrih, kjer je treba vodo popolnoma odstraniti iz notranjih por, saj se izračun radioaktivnosti usedline na filtru izvaja v steklenici s čistim toluenskim scintilatorjem. Preostala voda v porah lahko scintilatorju prepreči dostop do radioaktivne snovi. Dobro posušen filter v scintilatorju s toluenom je videti enakomerno prosojen. Sušenje poteka na zraku pri sobni temperaturi 15-20 minut (dokler vonj po etru ne izgine).

Položaj "volumetričnega" filtra v steklenici - leži na dnu ali stoji na robu - ne igra pomembne vloge. Svetlobni utrinki pri oddajanju (3-elektronov) bodo še vedno "osvetljevali" celotno tekočino v steklenički in jih bosta opazila oba fotopomnoževalca, vseeno pa je bolje, da membranski filter postavite na dno tako, da je film snovi obrnjen proti gor.

V primeru majhnih volumnov inkubacijske mešanice tudi pri prvi možnosti uporabe filtrov ni potrebno izvesti reakcije in sedimentacije polimera v prostornini za naknadno zbiranje oborine s filtracijo. Do 50 µl reakcijske mešanice lahko preprosto nanesete na papirnati filter in pustite, da absorbira tekočino. To operacijo je mogoče izvesti v enem koraku za več deset oštevilčenih filtrov, ki so vrstico za vrstico pritrjeni na plast gume, tako da se je ne dotikajo. Nato se guma s filtri postavi v vlažno komoro, termostatirano pri temperaturi encimske reakcije. Na koncu se filtri skupaj z zatiči odstranijo in postavijo v velik kozarec, napolnjen s 5% raztopino TCA ali etanola. V notranjosti filtrov bo prišlo do odlaganja polimerov. (Filtrov ne smemo odstraniti z bucik, saj jih bucike ščitijo pred zlepljanjem.) Vse pomivanje poteka tam, v kozarcu. Filtre nato ponovno nabodemo na gumo, posušimo in damo v viale s scintilatorjem po vrstnem redu številk.

Seveda se pri uporabi filtrov učinkovitost izračuna zmanjša v primerjavi z izračunom zdravila, raztopljenega v scintilatorju. Nekaj ​​energije (3-elektronov se izgubi v trkih z materialom usedline in mrežo prostorskega filtra. Vendar ni nujno, da P-elektron, ki je izgubil del energije, ne more povzročiti svetlobnega bliska v scintilatorju. In za pri štetju je pomembno le število impulzov na minuto in ne njihova amplituda (z izjemo dvojnega štetja). da bi po možnosti zmanjšali število impulzov, ki niso bili prešteti zaradi prevelike izgube energije na poti do scintilatorja.

Vnos radioaktivne oznake v biološke pripravke

a) notri viuo.

Najlažji način je, da težko in včasih nevarno operacijo vnosa oznake prepustite sami naravi. Da bi to naredili, se hranilnemu mediju doda radioaktivno označen prekurzor za sintezo snovi, ki nas zanima v telesu. To je najlažje narediti za bakterije. Označeni timidin se zlahka vključi v svojo DNK v 1 uri do ravni približno 10 % radioaktivnosti, vnesene v medij. Na enak način je DNK označena v živalskih celicah, ki rastejo v tkivni kulturi.

Pulzno označevanje v bakterijski mRNA se izvede z vnosom C-uracila ali istega P-ortofosfata v hranilni medij - po izčrpanju ali pranju neradioaktivnega fosforja. Zaradi hitrosti presnovnih procesov v bakterijah mora biti trajanje takega impulza kratko (10-30 sekund). Po tem je treba vitalno aktivnost bakterij takoj ustaviti, na primer z vlivanjem njihove suspenzije na fino zdrobljen led, ki vsebuje natrijev azid.

Najprimernejše je označevanje bakterijskih proteinov, pa tudi proteinov višjih organizmov v celični kulturi z uporabo C- ali S-označenega metionina. Naj vas spomnim, da je metionin esencialna aminokislina (se pravi, da se ne sintetizira v telesu samem) za celice vseh višjih živali in nekaterih bakterij. Poleg tega se z njim začne sinteza katere koli beljakovine, kar vam omogoča spremljanje začetka tega procesa.

Vnos sledilnih snovi s prehrano živali se praktično ne uporablja, saj so radioaktivni izotopi preko presnovnih poti vključeni v številne biološke molekule. Poleg tega pride do redčenja radioaktivne oznake zaradi lastnih rezerv telesa, na primer esencialnih aminokislin, pridobljenih kot posledica katabolizma (razgradnje) lastnih beljakovin. Vse to zahteva veliko porabo dragih radioaktivnih zdravil in je povezano s povečano stopnjo sevalne nevarnosti.

Pri tem velja opozoriti, da se radioaktivni označevalec vnaša oziroma natančneje ustvarja v aminokislinah, nukleotidih in drugih biološko pomembnih molekulah s posebnim obsevanjem v jedrskih reaktorjih. Katalogi specializiranih tujih podjetij vsebujejo več sto imen radioaktivno označenih molekul. Enako žal ne moremo reči za domače izdelke. b) notri vitro.

Vnos radioaktivne oznake v že očiščene proteine ​​ali nukleinske kisline je mogoče opraviti tudi v laboratoriju s kemičnimi reakcijami substitucije ali adicije radioaktivnih atomov, včasih pa tudi preprostih radioaktivno označenih molekul. Te reakcije so precej kompleksne in o njih nima smisla razpravljati. Pogosteje se oznaka vnese med in vitro encimskimi reakcijami za sintezo biopolimerov z uporabo radioaktivno označenih prekurzorjev (P-ATP, aminokisline, nukleozid trifosfati itd.). Nekateri encimi pritrdijo samo eno označeno enoto na konec verige ustrezen polimer.

Drugi encimi, ki vodijo in vitro komplementarno sintezo biopolimerov (DNA polimeraze, RNA polimeraze, ribosomski kompleksi) v prisotnosti radioaktivno označenih monomernih prekurzorjev (ribo- in deoksiribonukleozid trifosfati, aminoacil-tRNA), lahko vključujejo radioaktivno oznako v vseh ali nekaterih povezavah polimerne verige, zaradi česar imajo zelo visoko stopnjo radioaktivnosti.

Za zaključek je treba poudariti, da se zaradi varnosti in priročnosti zaznavanja rezultatov biosinteze v zadnjih letih pojavlja težnja po zamenjavi radioaktivne oznake s fluorescenčno, kar smo opazili že na primeru evolucije metode sekvenciranja DNK.

Literatura

1. Avdonin P.V., Tkachuk V.A. Receptorji in intracelularni kalcij. 1994. - Znanost, Moskva. - Str.29-42.

2. Avtsyn A.P., Zhavoronkov A.A., Rish M.A., Stročkova L.S. Človeški elementi v sledovih, medicina. M. - 1991.

3. Anestiadi V.Kh., Nagornev V.A. O pato- in morfogenezi ateroskleroze. Kišinjev, medicina. - 1985. - Str.92.

4. Antonov V.F. Lipidi in ionska prepustnost membran. - M.: Medicina, 1982.

5. Aronov D.M., Bubnova N.R., Perova N.V. in drugi Vpliv lovastatina na dinamiko lipidov in apoliproteinov v krvnem serumu po največji telesni aktivnosti v obdobju živilske lipemije pri bolnikih s koronarno arterijsko boleznijo // Kardiologija, - 1995. - T.35. - N 31. - Str.38-39.

6. Atadzhanov M.A., Bashirova N.S., Usmankhodzhaeva A.I. Spekter fosfolipidov v ciljnih organih pod kroničnim stresom // Patološki. fiziologija in eksperiment. terapija. - 1995, - N 3: - Str.46-48.

Avtoradiografija je razmeroma nova metoda, ki je izjemno razširila zmožnosti tako svetlobne kot elektronske mikroskopije. Gre za zelo sodobno metodo, ki izvira iz razvoja jedrske fizike, ki je omogočila pridobivanje radioaktivnih izotopov različnih elementov. Avtoradiografija zahteva zlasti izotope tistih elementov, ki jih uporablja celica ali se lahko vežejo na snovi, ki jih uporablja celica, in ki jih je mogoče dajati živalim ali dodajati kulturam v količinah, ki ne motijo ​​normalnega celičnega metabolizma. Ker radioaktivni izotop (ali z njim označena snov) sodeluje v biokemičnih reakcijah na enak način kot njegov neradioaktivni dvojnik in hkrati oddaja sevanje, lahko poti izotopov v telesu sledimo z različnimi metodami zaznavanja radioaktivnosti. . Eden od načinov zaznavanja radioaktivnosti temelji na njeni sposobnosti, da na fotografskem filmu deluje kot svetloba; vendar radioaktivno sevanje prodre skozi črni papir, ki se uporablja za zaščito filma pred svetlobo, in ima na film enak učinek kot svetloba.

Da bi lahko na preparatih, namenjenih preučevanju s svetlobnimi ali elektronskimi mikroskopi, zaznali sevanje, ki ga oddajajo radioaktivni izotopi, preparate v temnem prostoru premažemo s posebno fotografsko emulzijo in nato nekaj časa pustimo v temi. Nato pripravke razvijemo (tudi v temi) in fiksiramo. Območja zdravila, ki vsebujejo radioaktivne izotope, vplivajo na osnovno emulzijo, v kateri se pod vplivom oddanega sevanja pojavijo temna »zrna«. Tako so pridobljeni radioavtografi (iz grščine. radio– sevajo, avtomobili– sebe in grapho- napiši).

Sprva so imeli histologi le nekaj radioaktivnih izotopov; na primer številne zgodnje avtoradiografske študije so uporabljale radioaktivni fosfor. Kasneje se je začelo uporabljati veliko več teh izotopov; Radioaktivni izotop vodika, tritij, je našel posebno široko uporabo.

Avtoradiografija je bila in se še vedno zelo pogosto uporablja za preučevanje, kje in kako potekajo določene biokemične reakcije v telesu.

Kemične spojine, označene z radioaktivnimi izotopi, ki se uporabljajo za preučevanje bioloških procesov, imenujemo prekurzorji. Prekurzorji so običajno snovi, podobne tistim, ki jih telo dobi s hrano; služijo kot gradniki za gradnjo tkiv in so vgrajeni v kompleksne sestavine celic in tkiv na enak način, kot so vanje vgrajeni neoznačeni gradniki. Tkivno komponento, v katero je vgrajen označeni prekurzor in ki seva, imenujemo produkt.

Celice, gojene v kulturi, bodo, čeprav pripadajo istemu tipu, kadar koli na različnih stopnjah celičnega cikla, razen če se sprejmejo posebni ukrepi za sinhronizacijo njihovih ciklov. Z vnosom tritij-timidina v celice in nato izdelavo avtoradiografov pa je mogoče določiti trajanje različnih stopenj cikla. Čas začetka ene stopnje - mitoze - lahko določimo brez označenega timidina. V ta namen se vzorec celic iz kulture opazuje v faznokontrastnem mikroskopu, kar omogoča neposredno spremljanje poteka mitoze in določanje njenega časa. Trajanje mitoze je običajno 1 ura, čeprav v nekaterih vrstah celic traja do 1,5 ure.

Avtoradiografija

avtoradiografija, radioavtografija, metoda preučevanja porazdelitve radioaktivnih snovi v preučevanem predmetu z nanašanjem fotoemulzije, občutljive na radioaktivno sevanje, na predmet. Zdi se, da se radioaktivne snovi v predmetu fotografirajo (od tod tudi ime). Metoda A. se pogosto uporablja v fiziki in tehnologiji, v biologiji in medicini - povsod, kjer se uporabljajo izotopski indikatorji.

Po razvijanju in fiksiranju fotografske emulzije na njej dobimo sliko, ki prikazuje proučevano porazdelitev. Obstaja več načinov za nanašanje fotografske emulzije na predmet. Fotografsko ploščo lahko neposredno nanesemo na polirano površino vzorca ali pa na vzorec nanesemo toplo tekočo emulzijo, ki ob strditvi tvori plast tesno ob vzorcu in jo po osvetlitvi in ​​fotoprocesiranju pregledamo. Porazdelitev radioaktivnih snovi preučujemo s primerjavo gostote črnila fotografskega filma iz testnega in referenčnega vzorca (ti makroradiografija). Druga metoda je sestavljena iz štetja sledi, ki jih tvorijo ionizirajoči delci v fotografski emulziji, z optičnim ali elektronskim mikroskopom (mikroradiografija). Ta metoda je veliko bolj občutljiva kot prva. Za pridobivanje makroavtografov se uporabljajo prosojnice in rentgenske emulzije, za mikroavtografe pa posebne drobnozrnate emulzije.

Fotografska slika porazdelitve radioaktivnih snovi v preučevanem predmetu, pridobljena z metodo A., se imenuje avtoradiogram ali avtoradiogram.

Vklopljeno riž. 12 in 3 podani so primeri avtoradiogramov. Z metodo A. lahko ugotavljamo prisotnost radioaktivnih elementov v različnih rudiščih, porazdelitev naravnih radioaktivnih elementov v tkivih rastlinskih in živalskih organizmov itd.

Vnos spojin, označenih z radioizotopi, v telo in nadaljnja študija tkiv in celic z metodo A. omogoča pridobitev natančnih podatkov o tem, v katerih specifičnih celicah ali celičnih strukturah potekajo določeni procesi, lokalizacija določenih snovi in ​​​​določanje časovnih parametrov. številnih procesov. Na primer, uporaba radioaktivnega fosforja in A. je omogočila odkrivanje prisotnosti intenzivnega metabolizma v rastoči kosti; uporaba radioaktivnega joda in A. je omogočila razjasnitev vzorcev delovanja ščitnice; uvedba označenih spojin - prekurzorjev proteinov in nukleinskih kislin ter A. je pomagala razjasniti vlogo nekaterih celičnih struktur pri izmenjavi teh vitalnih spojin. Metoda A. omogoča določitev ne le lokalizacije radioizotopa v biološkem objektu, temveč tudi njegovo količino, saj je število reduciranih srebrovih zrn emulzije sorazmerno s številom delcev, ki delujejo nanjo. Kvantitativna analiza makroavtografov se izvaja z uporabo običajnih fotometričnih tehnik (glej Fotometrija) , in mikroavtografi - s štetjem srebrovih zrn ali sledi pod mikroskopom, ki so se pojavile v emulziji pod vplivom ionizirajočih delcev. A. se začne uspešno kombinirati z elektronsko mikroskopijo (glej Elektronska mikroskopija). Glej tudi radiografijo.

Lit.: Boyd D. A. Avtoradiografija v biologiji in medicini, trans. iz angleščine, M., 1957; Zhinkin L.N., Uporaba radioaktivnih izotopov v histologiji, v knjigi: Radioaktivni indikatorji v histologiji, L., 1959, str. 5-33; Perry R., Kvantitativna avtoradiografija, Metode v celični fiziologiji, 1964, v. jaz, pogl. 15, str. 305-26.

N. G. Hruščov.

riž. 2. Avtoradiogram (prstni odtis), ki prikazuje porazdelitev fosforja (32 P) v listih paradižnika. Rastlino so najprej dali v raztopino, ki je vsebovala radioaktivni fosfor. Svetla območja ustrezajo povečanim koncentracijam radioaktivnega izotopa; vidi se, da je fosfor koncentriran ob steblu in v žilnih delih listov.

riž. 1. Mikroradiogram vzorca niklja. Preučujemo difuzijo kositra, označenega z radioaktivnim izotopom 113 Sn, v niklju. Porazdelitev radioaktivnega kositra kaže, da se difuzija pojavlja predvsem vzdolž meja zrn niklja.

Velika sovjetska enciklopedija. - M.: Sovjetska enciklopedija. 1969-1978 .

Sopomenke:

Oglejte si, kaj je "avtoradiografija" v drugih slovarjih:

- (iz avto... in radiografija) metoda snemanja porazdelitve radioaktivnih snovi v objektu. Na površino (rez) se nanese film z emulzijo, občutljivo na radioaktivno sevanje. Zdi se, da se radioaktivne snovi same fotografirajo... ... Veliki enciklopedični slovar

- (avtradiografija), metoda za merjenje porazdelitve radioaktov. in v preučevanem predmetu (z lastnim sevanjem), ki je sestavljen iz nanosa plasti jedrske fotografske emulzije nanj. Porazdelitev je določena z gostoto črnenja, ki se kaže ... ... Fizična enciklopedija

Metoda za proučevanje porazdelitve radioaktivnih snovi (izotopov) v preučevanem predmetu ali spojinah. Sestavljen je iz nanašanja fotoemulzije, občutljive na radioaktivno sevanje, na predmet (ali npr. kromatogram) in pridobitve odtisa,... ... Mikrobiološki slovar

Samostalnik, število sinonimov: 4 avtoradiografija (2) makroavtoradiografija (1) ... Slovar sinonimov

Avtoradiografija. Glej avtoradiografijo. (Vir: "Angleško-ruski razlagalni slovar genetskih izrazov". Arefiev V.A., Lisovenko L.A., Moskva: Založba VNIRO, 1995) ... Molekularna biologija in genetika. Slovar.

avtoradiografija- Metoda za proučevanje porazdelitve radioaktov. komponente v proučevanem vzorcu z lastnim sevanjem z uporabo radioaktivnosti, občutljive na vzorec. emulzijsko sevanje. Porazdelitev je določena z gostoto črnenja, ki se kaže ... ... Priročnik za tehnične prevajalce

Avtoradiografija- * avtoradiografija * avtoradiografija glej ... Genetika. enciklopedični slovar

- (iz avto... in radiografija), metoda snemanja porazdelitve radioaktivnih snovi v objektu. Na površino (rez) se nanese film z emulzijo, občutljivo na radioaktivno sevanje. Zdi se, da se radioaktivne snovi same fotografirajo... ... enciklopedični slovar

knjige

• Avtoradiografija v biologiji in medicini, J. Boyd, Knjiga pripada enemu od ustvarjalcev metode avtoradiografije. Prvih osem poglavij je posvečenih teoriji vprašanja. Obravnavajo teorijo fotografskega postopka, lastnosti in značilnosti... Kategorija: Osnovno medicinsko znanje Založnik:

Označeni atomi se pogosto uporabljajo v citologiji za preučevanje različnih kemičnih procesov, ki se pojavljajo v celici, na primer: za preučevanje sinteze beljakovin in nukleinskih kislin, prepustnosti celične membrane, lokalizacije snovi v celici itd.

Za te namene se uporabljajo spojine, v katere se vnese radioaktivna oznaka.

V molekuli označene snovi, na primer aminokisline ali ogljikovega hidrata, je eden od atomov nadomeščen z atomom iste snovi, ki pa je radioaktiven, to je radioaktivni izotop. Znano je, da se izotopi istega elementa med seboj ne razlikujejo po svojih kemijskih lastnostih in ko se znajdejo v telesu živali ali rastline, se v vseh procesih obnašajo enako kot navadne snovi. Ker pa imajo ti izotopi radioaktivne emisije, jih je mogoče zlahka zaznati s fotografsko metodo.

V citoloških študijah so najbolj razširjeni umetni radioaktivni izotopi z mehkim sevanjem, pri katerih razpadni proces proizvaja elektrone z nizko energijo. Ti izotopi vključujejo: izotop vodika - tritij 3H, izotop ogljika 14C, fosfor 32P, žveplo 35S, jod 1311 in druge elemente, ki tvorijo organske spojine.

Označene spojine vnašamo neposredno v telo živali ali rastline, v celice, izolirane iz telesa, ki se nahajajo v tkivni kulturi, v celice protozojev in bakterij. Poti njihovega vnosa v telo so različne: pri večceličnih živalih jih vnašamo z injekcijo ali s hrano, pri celičnih in tkivnih kulturah, praživalih in bakterijah ter zelo majhnih večceličnih organizmih pa označene spojine vnašamo v telo. kulturni medij.

Radioaktivni izotopi, vneseni v telo, aktivno sodelujejo pri presnovi. Odmerek označene spojine, ki se vnese v telo, se določi eksperimentalno in ne sme biti prevelik, da ne bi motil normalnega metabolizma zaradi znatnega radioaktivnega sevanja.

V različnih časovnih intervalih po vnosu označenih spojin se posnamejo koščki tkiv in organov, praživali in bakterijske celice. Najboljše rezultate dosežemo s fiksiranjem z mešanico Carnoy ali alkoholno-ocetno mešanico (3:1). Navadne parafinske reze pripravimo iz fiksnega materiala, na katerega površino (po odstranitvi parafina) nanesemo tanko plast občutljive fotografske emulzije. Za to tako imenovano jedrsko emulzijo je značilna zelo majhna velikost zrn (0,2-0,3 l/s), njihova enakomernost in bistveno večja nasičenost želatine z AgBr kot običajna fotografska emulzija.

Preparate, na katere nanesemo fotografsko emulzijo, osvetlimo v temi, pri relativno nizki temperaturi (približno 4°C), nato pa jih razvijemo in fiksiramo na enak način kot pri običajnem fotografiranju. Med izpostavitvijo pripravkov sevanje radioaktivnih izotopov, vgrajenih v določene celične strukture, pusti sled poti beta delcev v fotoemulzijski plasti.

Med procesom razvijanja zrna AgBr, ki se znajdejo na mestih, kjer potujejo beta delci, razvijalec reducira v kovinsko srebro. Slednji so črne barve in jih zaznamo po tem, ko se pripravki razvijejo v obliki zrnc, ki se nahajajo v plasti fotografske emulzije nad tistimi celicami in njihovimi strukturami, v katere je vključen radioaktivni izotop. Takšna zdravila se imenujejo avtoradiografi.

Po procesih razvijanja in fiksacije se radioavtografi temeljito sperejo v vodi in nato obarvajo z enim od barvil, ki razkrijejo snov v celici, v katero naj bi se vključil radioaktivni izotop. Le nekatere vrste barvanja, kot je Feulgenova reakcija, se izvajajo pred nanosom emulzije na avtoradiografe, saj hidroliza v kislini in pri visokih temperaturah nujno poškoduje emulzijsko plast. Končane radioavtografe damo v kanadski balzam in pregledamo pod mikroskopom.

Vključitev radioaktivnih izotopov se izvaja samo na tistih področjih celic in njihovih struktur, kjer potekajo aktivni procesi, na primer procesi sinteze beljakovin, ogljikovih hidratov in nukleinskih kislin.

Različne označene aminokisline se uporabljajo za preučevanje sinteze beljakovin. O sintezi nukleinskih kislin lahko sodimo po vključitvi označenih nukleozidov v njihove molekule: timidin, citidin, uridin. S tritijem označen timidin, tj. 3H-timidin je vključen izključno v molekule DNA in s pomočjo tega posebnega radioaktivnega prekurzorja so v zadnjih letih razjasnili številne pomembne vzorce sinteze DNA in izsledili reduplikacijo kromosomov. 3H-citidin in 3H-uridin (ali iste spojine, označene z ogljikom) sta vključena v molekule DNA in RNA. Sintezo polisaharidov v celici lahko ocenimo po vključitvi označene glukoze in Na2S04 v njih.

V zadnjih letih je bila razvita metoda za pridobivanje avtoradiografov za njihovo preučevanje z uporabo elektronskega mikroskopa (elektronska avtoradiografija), ki omogoča preučevanje biokemičnih procesov v celičnih ultrastrukturah, to je pridobivanje natančnih podatkov o lokalizaciji kemičnih snovi in ​​njihovih transformacijah. v celicah različnih organelov.

Med kvantitativne metode sodijo predvsem številne biokemične metode, s katerimi lahko določimo količino anorganskih in organskih snovi v celici.

Vrednost teh metod, ki se pogosto uporabljajo v citologiji, je v tem, da omogočajo pridobivanje podatkov o spremembah količine različnih snovi v različnih obdobjih življenja celice, v različnih obdobjih njenega razvoja, pod vplivom okoljskih dejavnikov, med patološkimi procesi itd.

Kvantitativne metode omogočajo tudi pridobivanje digitalnih podatkov o snoveh, ki jih celica porabi in sprosti v svojem življenju. Tako z uporabo posebne opreme (respirometri Warburg, Krogh itd.). Zelo natančno lahko upoštevate količino kisika, ki ga porabijo tkiva ali posamezne celice, pa tudi tiste spremembe v intenzivnosti in procesih dihanja, ki se pojavijo pri različnih temperaturah in drugih pogojih.

Ena od pomembnih kvantitativnih metod, ki omogoča določanje suhe teže celice, temelji na uporabi interferenčnega mikroskopa. Bistvo te metode je, da je v interferenčnem mikroskopu svetloba, ki gre skozi objekt, podvržena faznemu zamiku v primerjavi s "kontrolnim žarkom", ki ni šel skozi objekt. Velikost faznega zamika se izraža v spremembi svetlosti in je odvisna od gostote predmeta, gostota pa je odvisna od količine suhe snovi v danem predmetu. Suha teža celic ali njihovih posameznih struktur je izražena v gramih, za izračun pa morate izmeriti velikost celice (ali njene posamezne strukture), pa tudi velikost faznega premika.

Metoda določanja suhe teže z interferenčnim mikroskopom je uporabna ne le za fiksne, ampak tudi za žive celice.

Druga pomembna in široko uporabljena metoda za kvantitativno analizo kemijske sestave celice je citopotometrija. Osnova citopotometrične metode je določanje količine kemičnih snovi z njihovo absorpcijo ultravijolične, vidne ali infrardeče svetlobe določene valovne dolžine.

Kvantitativno analizo lahko izvajamo tako na podlagi lastnih absorpcijskih spektrov kemičnih snovi (tj. na neobarvanih preparatih) kot tudi na podlagi absorpcijskih spektrov barvila, ki obarva celične strukture. Primer je določanje količine DNA na preparatih, obarvanih s Feulgenom, in količine RNA po barvanju s pironinom.

6. Citopotometrija.

Absorpcija svetlobe v različnih celičnih strukturah je odvisna od koncentracije določenih kemičnih snovi v njih, za to odvisnost pa velja Lambert-Beerov zakon: intenzivnost absorpcije žarkov je sorazmerna s koncentracijo snovi pri enaki debelini. predmet. Razlike v intenzivnosti absorpcije svetlobe s kemikalijami, lokaliziranimi v različnih celičnih strukturah, so izražene v kvantitativnih kazalnikih, ki so pogosto relativne enote, mikrogrami in druge merske enote.

Instrumenti, ki se uporabljajo za spektralno analizo kemijske sestave celic, se imenujejo citopotometri. Citopotometer vključuje vir svetlobe, filter, mikroskop in fotometer s fotopomnoževalnikom. Slika celice se projicira na fotopomnoževalno cev.

S citopotometrom se določi intenzivnost svetlobe, ki prehaja skozi celico, oziroma njena obratna vrednost, to je optična gostota. Dobljene vrednosti primerjamo z enakimi vrednostmi, znanimi za druge celice, ali s standardnimi vzorci.Citofotometri različnih sistemov omogočajo določanje količine snovi do 10-12-14 g, tj. odlikuje visoka natančnost merjenja.

Metoda citopotometrije se je v zadnjih letih še posebej razširila. Zelo pomembno je dejstvo, da ga je mogoče kombinirati z drugimi raziskovalnimi metodami, na primer z ultravijolično mikroskopijo.

Avtoradiografska metoda

Avtoradiografija, definicija, zgodovina.

Avtoradiografska metoda temelji na vnosu spojine, "označene" z radioaktivnim atomom, v predmet, ki se preučuje, in določitvi mesta njegove vključitve s fotografskim zapisom sevanja. Osnova za pridobitev slike je učinek ionizirajočih delcev, ki nastanejo pri razpadu radioaktivnega atoma, na jedrsko fotografsko emulzijo, ki vsebuje kristale srebrovega halida.

Odkritje metode avtoradiografije je neposredno povezano z odkritjem pojava radioaktivnosti. Leta 1867 je bilo objavljeno prvo opazovanje vpliva uranovih soli na srebrove halogenide (Niepce de St. Victor). Leta 1896 je Henry Becquerel opazoval osvetljevanje fotografske plošče z uranovimi solmi brez predhodne izpostavljenosti svetlobi. Ta poskus velja za trenutek odkritja pojava radioaktivnosti. Avtoradiografijo v zvezi z biološkim materialom sta prva uporabila Lacassagne in Lattes (Lacassagne, Lattes 1924) v dvajsetih letih prejšnjega stoletja; Histološki blok iz različnih živalskih organov smo po vnosu izotopov z ravno stranjo pritisnili na rentgensko ploščo in osvetlili. Histološki odsek je bil pridobljen vnaprej in izpostavljen standardnemu postopku obarvanja. Nastali avtogram je bil preučen ločeno od rezine. Ta metoda vam omogoča, da ocenite intenzivnost vključitve izotopa v biološki vzorec. V štiridesetih letih je Leblond uporabil avtoradiografijo za prikaz porazdelitve izotopa joda v odsekih ščitnice (Leblond C.P. 1943).

Prvi poskusi združitve avtoradiografije z elektronsko mikroskopijo so bili narejeni v 50. letih (Liquir-Milward, 1956). Elektronsko mikroskopska avtoradiografija je poseben primer klasične avtoradiografije, pri kateri se srebrova zrna tudi štejejo in upošteva njihova porazdelitev. Posebnost metode je uporaba zelo tanke plasti emulzije. Trenutno je dosežena ločljivost okoli 50 nm, kar je 10-20-krat več v primerjavi s svetlobno mikroskopijo.

Trenutno je metoda avtoradiografije dopolnjena z možnostjo samodejnega ocenjevanja števila srebrovih zrn z uporabo video analizatorjev. Pogosto se za ojačanje signala oznake (običajno so to izotopi z visoko energijo) uporabljajo različne vrste scintilatorjev, nanesenih na plošče (ojačevalni zaslon s fosfornim premazom) ali impregniranih v emulzijo (PPO) - v tem primeru , fotonsko sevanje osvetli običajno fotografsko ploščo ali film.

Fotografski princip pridobivanja slike, fotoemulzija

Pri radiografskih raziskavah ima vlogo detektorja jedrskega razpada fotografska emulzija, v kateri ob prehodu ionizirajočega delca ostane latentna slika, ki se nato razkrije v procesu razvijanja, podobno kot pri obdelavi običajnega fotografskega filma.

Fotografska emulzija je suspenzija mikrokristalov srebrovega halida v želatini. Mikrokristali imajo v svoji strukturi napake, imenovane centri občutljivosti. V skladu z modelom Gurney-Mott lahko te motnje v ionski mreži kristala zajamejo elektrone, ki se sprostijo, ko delec alfa ali beta preide skozi prevodni pas kristala, zaradi česar se ion spremeni v atom. Nastala latentna slika se lahko razkrije s postopkom, ki pretvori aktivirane kristale srebrovega halogenida v zrna kovinskega srebra (proces, imenovan kemično razvijanje). Kot razvijalec se lahko uporabi katero koli sredstvo z zadostno redukcijsko aktivnostjo (v fotografiji in avtoradiografiji se običajno uporabljajo metol, amidol ali hidrokinon). Ko se izpostavljeni kristali razvijejo, se preostali mikrokristali srebrovega halida odstranijo iz emulzije s fiksativom (običajno hiposulfitom). Jedrske fotografske emulzije odlikujeta ločljivost (zrnatost) in občutljivost. Prva je določena z velikostjo mikrokristalov srebrove soli in je obratno sorazmerna z slednjo. Za fotografsko emulzijo je značilna zmanjšana občutljivost na vidno svetlobo, vendar je treba z njo delati v temi, da preprečimo pojav artefaktov.

Emulzijo lahko nanesemo na zdravilo v obliki končnega filma s substratom ali s potopitvijo zdravila v segreto tekočo emulzijo - tako dobimo tanek, enakomeren sloj, ki ga razvijemo na običajen način. Pred nanosom emulzije za svetlobno mikroskopijo se stekelec običajno obarva z zahtevanim histološkim madežem, vendar v svetlejši barvi kot običajno, da se omogoči štetje srebrovih zrn na vseh področjih. Zdravilo je izpostavljeno določen čas in se nato razvije.

Izotopi, ki se uporabljajo v avtoradiografiji.

V radioavtografiji je, odvisno od namenov študije in razpoložljivih materialov, možna uporaba različnih izotopov. Slika, ki jo ustvari ionizirajoči delec na jedrski fotografski emulziji, je odvisna od energije delca in vrste njegove interakcije s snovjo.

Alfa delci, ki jih oddajajo enaka radioaktivna jedra, imajo enako energijo ( E) in enako dolžino poti ( R) , povezana z naslednjo relacijo:

R = kE3/2

Kje k – konstanta, ki označuje medij, v katerem se delci širijo. Razpon delcev v jedru je določen z njegovo gostoto in elementarno sestavo. Bragg-Kleemenova relacija nam omogoča oceno razpona alfa delcev v zraku (R0) v snovi z atomsko maso A in gostoto d:

R= 0,0003 (R0/ d) A1/2

Ker je ionizacijska sposobnost alfa delcev zelo visoka, to olajša fotografsko snemanje porazdelitve izotopov, omogoča pa tudi uporabo neemulzijskih materialov za snemanje. Sled alfa delcev, ki jih oddaja en vir, se na avtogramih pojavi kot žarek ravnih segmentov, običajno dolgih 15-50 mikronov, ki izhajajo iz ene točke, kar omogoča natančno lokalizacijo območja, kjer je radioaktivna oznaka. Vendar alfa delce oddajajo izotopi z visokim atomskim številom, kar omejuje njihovo uporabo kot biološki marker.

Sledi delcev alfa so na histoloških rentgenskih slikah pogosto opazne kot artefakt – rezultat lastne emisije izotopov, ki so prisotni na preparatu.

Za sevanje beta je značilen zvezen spekter začetne energije delcev - od nič do E max, določene za vsak izotop. Oblike spektra so bistveno drugačne. Tako je najverjetnejša energija delcev, ki jih oddaja tritem, 1/7 E max, 14C približno ¼, 32P približno 1/3. Največja energija sevanja beta različnih izotopov se giblje od 18 keV do 3,5 MeV – v veliko širših mejah kot pri sevanju alfa. Praviloma je največja energija višja pri kratkoživih izotopih.

Prehod beta delcev in monoenergijskih elektronov skozi snov spremljata dve glavni vrsti interakcij. Pri interakciji z orbitalnim elektronom lahko delec nanj prenese energijo, ki je dovolj za ionizacijo atoma (odstranitev elektrona iz orbite). V redkih primerih je ta energija tako visoka, da je mogoče opazovati sled sproščenega elektrona. Zaradi enakosti mas delca in elektrona pride do odstopanja od začetnega gibanja. Interakcija druge vrste, z atomskimi jedri, vodi do pojava zavornega rentgenskega sevanja. Čeprav slednjega emulzija ne registrira, lahko dejanje interakcije delca z jedrom zaznamo z ostrim prelomom poti.

Ponavljajoča se interakcija z orbitalnimi elektroni povzroči ukrivljenost trajektorije, ki je običajno videti kot vijugasta črta, zlasti v končnem delu, ko se hitrost delca zmanjša in njegova ionizacijska moč poveča. Dolžina trajektorije bistveno presega razdaljo od začetne do končne točke proge - kilometrino. Zaradi tega je tudi za monoenergetske elektrone značilna prisotnost spektra območja, ki je zgoraj omejen z R max, kar je značilno za dano sevanje. Zaradi manjših ionizacijskih izgub je delce beta težje zaznati kot delce alfa. Ne tvorijo neprekinjenih sledi (razen za najmehkejše sevanje tritija - vendar je v tem primeru verjetnost prehoda več kot enega emulzijskega kristala majhna), gostota in število razvitih kristalov se spreminjata v različnih mejah. Doseg beta delca v drugem elementu je mogoče oceniti z uporabo formule:

R = RA1 (Z/A)A1/ (Z/A)

V širokem razponu vrednosti E maks Največja kilometrina je povezana z največjo energijo z razmerjem:

R m= 412 E maks 1,265 – 0,0954 ln E maks

Razlike v območjih, ionizacijski zmogljivosti in gostoti razvitih emulzijskih kristalov delcev z različnimi energijami lahko uporabimo za razlikovanje porazdelitve elementov, če se njihovi izotopi bistveno razlikujejo v E max, kot je to v primeru tritija in 14C. Razlikovanje porazdelitve dveh izotopov se izvede z nanosom dveh emulzijskih plasti na vzorec, pri čemer prva plast registrira pretežno mehko sevanje, druga pa trdo sevanje. Po nekaterih študijah lahko različne izotope zanesljivo ločimo po velikosti razvitih kristalov emulzije – kristali, na katere vpliva delček tritija beta, ki ima večjo ionizacijsko sposobnost, so večji.

Notranji pretvorbeni elektroni nastanejo, ko se absorbira kvant gama z zelo nizko energijo sevanja in se elektron odstrani iz notranje lupine atoma. Ti elektroni so podobni mehkim beta delcem, vendar so za razliko od slednjih monoenergetski. Prisotnost notranjih pretvornih elektronov omogoča uporabo izotopov, kot je 125I.

Trenutno so najpogosteje uporabljeni izotopi tisti, ki oddajajo delce beta. Praviloma se tritij uporablja za označevanje v histoloških študijah. Prvi avtogrami z uporabo tritija so bili izdelani že v 50-ih (Fitzgerald et al. 1951), vendar se je njegova široka uporaba začela po pridobitvi s tritijem označenega timidina v laboratoriju Brookhaven. Ker je vodik del vseh organskih snovi, je z uporabo tritija mogoče pridobiti različne spojine, ki nosijo radioaktivno oznako. Nižja kot je energija oddanega delca, krajša je sled, ki jo pusti pri premikanju v fotografski emulziji, in natančneje je mogoče lokalizirati lokacijo označenega atoma. Dolžina poti beta delcev tritija je približno 1-2 mikrona, najverjetnejša energija je 0,005 MeV, sled pa je v večini primerov sestavljena iz enega zrna srebra, kar omogoča lokalizacijo vira sevanja ne le v razmeroma velikih celičnih strukturah, kot je jedro, ampak tudi v posameznih kromosomih.

Vnos »označenih« metabolitov v telo omogoča sledenje vgradnji izotopa v celice živalskega tkiva, kar omogoča preučevanje različnih biokemičnih procesov v živem organizmu.

Pridobivanje absolutnih podatkov - koncentracije označene snovi v proučevanem objektu - je redko cilj avtoradiografskih raziskav, to zahteva poznavanje številnih pogojev, katerih določitev je težavna. Zato se kvantitativne avtoradiografske študije običajno izvajajo s primerjavo koncentracije srebrovih zrn nad preučevanim predmetom in kontrolo, pri čemer je priročno vzeti kontrolne podatke kot eno ali 100 %.

Značilnosti nekaterih uporabljenih izotopov

v avtoradiografiji bioloških objektov